益生菌可通過調(diào)節(jié)腸道菌群介導(dǎo)不同宏基因組途徑產(chǎn)生抗肥胖作用

肥胖在世界范圍內(nèi)日益流行，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（gluts，主要是glut1和glut4）是脂肪特異性甘油三酯儲(chǔ)存的重要決定因素，與肥胖有關(guān)。益生菌是活的微生物，當(dāng)攝入足夠時(shí)，對(duì)人類產(chǎn)生有益作用，部分益生菌具有降血糖和抗肥胖作用，可調(diào)節(jié)glut介導(dǎo)的葡萄糖攝取。

干酪乳酪桿菌Zhang（Lactobacillus casei Zhang，LCZ）先前被證實(shí)對(duì)攝入高熱量的大鼠可以降低血脂和防止血糖受損,然而腸道微生物群如何調(diào)控glut1及葡萄糖攝取活性的機(jī)制尚未闡明。   

本實(shí)驗(yàn)旨在研究腸道絨毛特異性glut1在肥胖中的作用，以及在沒有腸道絨毛特異性glut1表達(dá)的情況下，LCZ干預(yù)的抗肥胖作用機(jī)制，比較了高脂飲食喂養(yǎng)的絨毛特異性glut1敲除（KO）小鼠和經(jīng)過或不經(jīng)過LCZ干預(yù)對(duì)照組小鼠（glut1 flox/flox）之間的體重、腸道菌群擾動(dòng)、脂肪質(zhì)量積累和葡萄糖耐量（通過口服葡萄糖耐量試驗(yàn)），并通過宏基因組測序來評(píng)價(jià)腸道微生物群。結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，絨毛特異性glut1 KO小鼠在中期前期有更多的脂肪沉積，糖耐量受損，腸道微生物群有明顯的改變。益生菌降低了KO型和對(duì)照組小鼠的體重、腸系膜和腎周白色脂肪組織（WAT）的重量，并調(diào)節(jié)其腸道微生物群。結(jié)果表明消除腸道上皮細(xì)胞glut1的活性會(huì)影響腸道菌群、脂肪積累和葡萄糖耐量，使用LCZ可減少脂肪積累和中心性肥胖。    

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有小鼠（8周齡）均被喂食高脂飲食（脂肪60%千卡，碳水化合物20%千卡，蛋白質(zhì)20%千卡），共有5組小鼠，LCZ干預(yù)組的小鼠每日灌胃4x109CFU活菌，其他兩組每日注射等量的生理鹽水。所有小鼠在第21周被處死，收集合并附睪、腎周和腸系膜的白色脂肪組織（WAT）并進(jìn)行稱重。小鼠腸系膜脂肪樣本均在4%多聚甲醛中固定48h，用乙醇和二甲苯梯度脫水后，將組織包埋在石蠟中，切成5μm厚的切片，用蘇木精和伊紅對(duì)石蠟切片染色，然后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查。為了進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT），葡萄糖灌胃劑量為每公斤體重2g，在灌胃前（空腹12h）和灌胃后15、30、45、60、90、120min采用Accu血糖監(jiān)測儀檢測小鼠血糖水平。使用商業(yè)試劑盒從小鼠尾巴中提取基因組DNA，采用引物對(duì)2.85F/2.9R和creF/creR進(jìn)行PCR檢測，確定動(dòng)物glut1基因型。使用QIAamp DNA stool mini kits 從糞便（所有五個(gè)組）和小腸內(nèi)容物（2個(gè)KO小鼠組）中提取細(xì)菌總DNA。使用超過1μg的高質(zhì)量DNA 和NEBNext ultra DNA文庫制備試劑盒構(gòu)建DNA文庫。構(gòu)建的測序文庫用索引碼進(jìn)行標(biāo)記，文庫的制備工作在Illumina HiSeq平臺(tái)上進(jìn)行測序。對(duì)于GV和GVP中的小腸菌群，使用PacBio RSII儀器對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行測序，并根據(jù)之前的研究進(jìn)行分析。

前言

肥胖是各種代謝性疾病的主要危險(xiǎn)因素，包括代謝綜合征和Ⅱ型糖尿病。世界上超過一半的人口超重，中心性肥胖比一般肥胖具有更高的代謝紊亂和冠心病的風(fēng)險(xiǎn)，其特點(diǎn)是腹腔內(nèi)臟（網(wǎng)膜和腸系膜）堆積，而對(duì)中心性肥胖的評(píng)估是基于腰圍、腰臀比和體重指數(shù)。腸系膜脂肪厚度是代謝綜合征所有組成部分的獨(dú)立決定因素，被認(rèn)為是脂肪肝、代謝綜合征和多囊卵巢綜合征的指標(biāo)。與皮下和腹膜前脂肪厚度相比，腸系膜脂肪厚度與心血管危險(xiǎn)因素也表現(xiàn)出更強(qiáng)的相關(guān)性。在動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)高脂肪飲食可誘導(dǎo)腸系膜脂肪的積累，因此腸系膜脂肪是導(dǎo)致肥胖發(fā)展和并發(fā)癥的主要原因。 

葡萄糖是在甘油三酯（TG）中構(gòu)建甘油酯-甘油主干所必需的。葡萄糖從腸道和其他組織攝取脂肪細(xì)胞的速率影響TG積累，很明顯腸系膜脂肪與腸道緊密相連。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（glut1）損傷被認(rèn)為是脂肪積累和葡萄糖耐量的一種機(jī)制，glut1在體內(nèi)具有多種生理功能，包括維持全身的葡萄糖穩(wěn)態(tài)，特別是在大腦、肌肉、脂肪、腸道和神經(jīng)元系統(tǒng)中。首先，大腦葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受損多見于glut1缺乏癥的兒童，而glut1活動(dòng)的缺乏會(huì)導(dǎo)致癲癇、運(yùn)動(dòng)異常、認(rèn)知障礙等疾病。其次，在癌癥病例中glut1的表達(dá)在癌細(xì)胞中被高度激活，將葡萄糖大量輸入細(xì)胞，以應(yīng)對(duì)由于生長異常而導(dǎo)致的高局部能量需求。第三，glut1轉(zhuǎn)運(yùn)體的高表達(dá)與葡萄糖水平降低相關(guān)，提示其在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要意義，這些觀察結(jié)果表明，glut1可能是導(dǎo)致肥胖及其相關(guān)因素的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

盡管越來越多的證據(jù)表明葡萄糖攝取和肥胖之間存在密切聯(lián)系，但很少有研究確定腸道微生物群在調(diào)節(jié)glut1中的作用，以及它們?cè)趯?dǎo)致肥胖中的交互作用。本研究旨在探討腸道特異性glut1的表達(dá)是否對(duì)肥胖有任何影響，以及這種機(jī)制是否是通過腸道微生物群的調(diào)節(jié)。此外，這項(xiàng)研究還旨在尋找促進(jìn)高脂肪誘導(dǎo)的肥胖關(guān)鍵微生物。通過對(duì)微生物宏基因組組成和途徑的分析，探討了干酪乳酪桿菌Zhang對(duì)腸道黏膜表面脂肪分布的有益影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HFD喂養(yǎng)的絨毛特異性glut1 KO小鼠的體重大于對(duì)照組小鼠（GV vs GF，P<0.05；），而兩組的體重在第18周后變得（P>0.05；）。經(jīng)過13周的飲食干預(yù)后，接受LCZ處理的預(yù)防組或治療組的小鼠比未接受小鼠體重低，這種趨勢(shì)一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束（GFP和GFT，P<0.001；）。喂食LCZ和HFD的glut1 CKO小鼠的體重也明顯低于只喂食HFD的glut1 CKO小鼠（GVP vs GV，P<0.001；）。LCZ預(yù)防組的glut1 fl/fl小鼠（GFP）相比非治療組（GFT）在OGTT 30min時(shí)血糖水平下降（；P<0.05）。與glut1 fl/fl小鼠相比，OGTT中絨毛特異性glut1 KO小鼠在30min時(shí)顯示血糖水平急劇升高（P<0.05；）。然而LCZ并不能糾正LCZ治療組glut1 CKO小鼠的血糖耐量異常（P>0.05；）。 

為了確定LCZ攝入是否減少不同部位的白色脂肪積累量，在第21周時(shí)對(duì)小鼠的脂肪組織、附睪、腎周和腸系膜脂肪稱重。在LCZ處理的兩種小鼠中，除eWAT之外，pWAT和mWAT的重量都降低（P<0.05或P<0.001）。與HFD-glut1 CKO小鼠相比，HFD-glut1 fl/fl小鼠腎周脂肪的重量減少，而腸系膜脂肪的重量沒有變化。此外，在LCZ處理的兩種類型的小鼠中，mWAT的脂肪細(xì)胞大小均減小（3E；P<0.001）。

與LCZ處理組相比，HFD喂養(yǎng)的對(duì)照組小鼠和絨毛特異性glut1 KO小鼠的Firmicutes/Bacteroidetes比值降低（P<0.01），在屬水平上，HFD喂養(yǎng)的glut1 CKO小鼠和glut1 fl/fl小鼠的Bacteroides 相對(duì)豐度降低，而該屬通過LCZ干預(yù)富集。Ruminococcus在HFD喂養(yǎng)的glut1 CKO小鼠中大大減少，但在glut1 fl/fl小鼠中被富集，并且通過LCZ處理促進(jìn)。

主坐標(biāo)分析表明，去除絨毛特異性glut1的表達(dá)對(duì)腸道菌群有深遠(yuǎn)影響。LCZ處理調(diào)節(jié)了腸道菌群，絨毛特異性glut1 KO小鼠表現(xiàn)出比對(duì)照組小鼠更高的細(xì)菌多樣性（P<0.001），但在經(jīng)過和不經(jīng)過LCZ處理的小組之間沒有發(fā)現(xiàn)差異。

喂養(yǎng)的野生型小鼠與絨毛特異性glut1 KO小鼠之間腸道物種的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)采用Spearman相關(guān)分析。黃色實(shí)心/灰色虛線邊分別表示Spearman秩相關(guān)系數(shù)為>0.5和<?0.5。邊的寬度代表相關(guān)性的強(qiáng)度（邊緣越寬，相關(guān)性越強(qiáng)）。  

在glut1 CKO小鼠和使用或不使用LCZ的對(duì)照組小鼠中發(fā)現(xiàn)了20個(gè)差異豐富的KEGG通路，而給HFD-glut1 CKO小鼠注射LCZ會(huì)耗盡腸道微生物組中的這20個(gè)KEGG通路（與glut1 CKO小鼠相比），這表明攝入LCZ可能會(huì)降低大量微生物酶的功能。這些KEGG通路主要與輔助因子和維生素生物合成、脂肪酸代謝、ATP合成、代謝能力和碳固定參與能量代謝有關(guān)，與未接受益生菌的glut1 fl/fl小鼠相比，給予LCZ的glut1 fl/fl小鼠微生物組中富集（GFP vs GF）。與HFD-glut1 fl/fl小鼠相比，HFD-glut1 CKO小鼠中15個(gè)KEGG通路的基因豐度富集，表明glut1基因影響微生物酶功能，而不是與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的影響，由于抑制宿主腸道glut1的表達(dá)，屬于磷酸鹽和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的糖、多元醇和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的KEGG通路在glut1 CKO小鼠微生物組中富集，因此LCZ的攝入似乎調(diào)節(jié)了這兩種KEGG通路。

討論

本研究采用條件敲除小鼠模型，研究了腸道特異性glut1、腸道微生物群和中心性肥胖之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)益生菌株LCZ通過有益調(diào)節(jié)腸道微生物群，降低了野生型小鼠和絨毛特異性glut1 KO小鼠的肥胖（特別是通過調(diào)節(jié)不同的腎周脂肪沉積）。 與LCZ類似，給予Lactobacillus plantarum HAC01可減少小鼠的腸系膜脂肪沉積，HFD可誘導(dǎo)腸系膜脂肪中炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA水平升高，而腎周脂肪和附睪脂肪水平不升高，因此腸系膜脂肪被認(rèn)為是炎癥性脂肪，有助于增加腸道通透性、微生物群的改變和全身炎癥，腎周脂肪過多可導(dǎo)致脂肪毒性和腎臟損傷。

另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，益生菌菌株Bacillus subtilis SJLH001可以降低腎周脂肪和pWAT肌酐水平，與減輕腎小球擴(kuò)張有關(guān)，因此LCZ介導(dǎo)的腎周脂肪減少可能是對(duì)HFD誘導(dǎo)的腎臟損傷有保護(hù)作用。

數(shù)據(jù)顯示LCZ不僅阻止了HFD喂養(yǎng)小鼠腸系膜和腎周脂肪的積累，而且還減少了glut1缺陷高血糖小鼠腸系膜和腎周脂肪的沉積。因此研究在糖尿病患者中是否存在類似的降脂作用和機(jī)制是很有意義的。 glut1介導(dǎo)葡萄糖進(jìn)入大腦，它是一種血腦屏障必需的蛋白質(zhì)，促進(jìn)從血液循環(huán)中吸收葡萄糖，然而腸道絨毛glut1在介導(dǎo)肥胖中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用尚不清楚。證據(jù)表明腸道通透性的增加和Ⅱ型糖尿病與肥胖密切相關(guān)，其特征是腸道微生物群的改變和炎癥性。

此外已知腸道通透性的增加會(huì)造成肥胖中脂肪積累和胰島素抵抗，與glut1 fl/fl小鼠相比，glut1 CKO小鼠有更高的初始體重、快速的脂肪積累和OGTT在30min時(shí)血糖水平的急劇升高，表明腸道絨毛葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的損傷可能影響腸道通透性，這種影響通過調(diào)節(jié)腸道微生物群發(fā)揮作用，而腸道絨毛glut1 CKO小鼠的腸道微生物群組成與glut1 fl/fl小鼠有很大的不同。 腸道微生物群在人類和動(dòng)物的能量獲取與肥胖中都起著致病作用，其改變影響腸道通透性，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生慢性炎癥。研究觀察到HFD喂養(yǎng)的glut1 CKO小鼠和HFD喂養(yǎng)的glut1 fl/fl小鼠腸道微生物組存在差異。

先前的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥小體缺乏小鼠中Barnesiella intestinihominis多于對(duì)照組小鼠，且與肝臟脂肪變性加重相關(guān)。此外在用空腹誘導(dǎo)的高血糖小鼠糞便移植的小鼠中，B. intestinihominis是導(dǎo)致HFD誘導(dǎo)的脂肪性肝炎的關(guān)鍵腸道微生物，在glut1 CKO小鼠中，B. intestinihominis與WAT快速增加之間存在相關(guān)性，而LCZ干預(yù)降低了腸道B. intestinihominis的相對(duì)豐度，從而降低了glut1 CKO小鼠中mWAT和pWAT的重量。Faecalibaculum rodentium是glut1 CKO小鼠中的另一種富集微生物，雖然是SCFA產(chǎn)生者并且能發(fā)揮抗癌作用，但微生物的SCFAs可能為宿主提供額外的能量促進(jìn)肥胖。 腸道中低比例的Firmicutes/Bacteroidetes通常被認(rèn)為是人類和動(dòng)物肥胖的生物標(biāo)志物，益生菌LCZ干預(yù)增加了HFD喂養(yǎng)的glut1 CKO小鼠和