蛋白純化常用方法簡介

前言

層析技術(shù)早在1903年就應(yīng)用于植物色素的分離提取，各種顏色的色素從上到下在吸附柱上排列成色譜，也稱色譜分離法。1931年有人用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構(gòu)體，顯示了這一分離技術(shù)的高度分辨力，從此引起了人們的廣泛注意。隨著人們對層析技術(shù)的認(rèn)識和實踐的提高以及物理化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用范圍更加廣泛，沒有顏色的物質(zhì)同樣可用此法分離，這時的工作全是使用吸附劑的吸附層析法。自1944年應(yīng)用濾紙作為固定支持物的紙層析誕生，層析技術(shù)的發(fā)展越來越快。20世紀(jì)50年代開始，相繼出現(xiàn)了氣相層析和高壓液相層析，其他如薄層層析、薄膜層析、親和層析、凝膠層析等也迅速發(fā)展。在生物化學(xué)領(lǐng)域里，層析技術(shù)已成為一項常用的分離分析方法。

層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)都由兩個相組成：一是固定相，它或者是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；另一是流動相，即可以流動的物質(zhì)，如水和各種溶媒。當(dāng)待分離的混合物隨溶媒（流動相）通過固定相時，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同，而且隨溶媒向前移動，各組份不斷地在兩相中進(jìn)行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，向前移動的速度快。反之，與固定相相互作用越強(qiáng)的組份，向前移動速度越慢。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達(dá)到將各組份分離的目的。

按層析原理可將層析分為：

1.親和層析

利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離的目的。將可親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當(dāng)含混合組分的樣品通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，性無關(guān)組分隨流動相流出。改變流動相組分，可將結(jié)合的親和物洗脫下來。親和層析中所用的載體稱為基質(zhì)，與基質(zhì)共價連接的化合物稱配基。具有專一親和力的生物分子對主要有：抗原與抗體，DNA與互補(bǔ)DNA或RNA，酶與底物、激素與受體、維生素與特異結(jié)合蛋白、糖蛋白與植物凝集素等。親和層析可用于純化生物大分子、稀釋液的濃縮、不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏、分離核酸等。

特點：親和層析具有高選擇性、高純度、快速、濃縮等特點，在重組蛋白的分離中多作為第一步的粗純，實現(xiàn)對絕大部分雜質(zhì)蛋白的去除。

2.離子交換層析

采用具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動相中的離子能進(jìn)行可逆交換的性質(zhì)來分離離子型化合物的方法。主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其他帶電荷的生物分子。不同蛋白質(zhì)的等電點（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH緩沖液條件下所帶正/負(fù)凈電荷不同，選擇不同的離子交換柱實現(xiàn)分離。

特點：離子交換層析屬于吸附性分離方式，純化過程中它具有可逆、操控性強(qiáng)及實現(xiàn)樣品濃縮等特點。在精純實驗中是常與其它方法相結(jié)合使用的主要技術(shù)。

3.凝膠過濾層析

又稱分子篩過濾或排阻層析等，根據(jù)大小和形狀分離，這種分離方式是非吸附性的，整個分離過程中只需要一種緩沖液，實驗操作方便醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理固定相是多孔凝膠，各組分的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度也不同。本法的優(yōu)點是所用凝膠屬于惰性載體，吸附力弱，操作條件溫和，不需要有機(jī)溶劑，對高分子物質(zhì)有很好的分離效果。常用的凝膠有Sephadex G系列。凝膠層析可用于脫鹽、分離提純、測定高分子物質(zhì)的分子量、高分子溶液的濃縮等。在峰譜圖中，出峰順序是：大分子先流出層析柱，小分子后出。

特點：層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對分離成分理化性質(zhì)的保持有獨到之處。對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。

4.疏水相互作用層析

依據(jù)生物分子間疏水性差別實現(xiàn)分離的一種層析方式。高離子強(qiáng)度下，增進(jìn)蛋白質(zhì)中的疏水性氨基酸與層析介質(zhì)間的疏水性相互作用，削弱其靜電作用力。洗脫時，降低流動相離子強(qiáng)度，削弱蛋白質(zhì)分子與層析介質(zhì)間的疏水作用，實現(xiàn)目的蛋白的純化和收集。

特點：疏水作用層析也屬于吸附性分離方式，對具有疏水特性的目的蛋白具有高選擇性和濃縮等特點。疏水相互作用層析可以用于捕獲、中度純化或精細(xì)純化階段。由于樣品應(yīng)該在高些的鹽濃度下來促進(jìn)疏水相互作用，疏水相互作用層析很好的適用于在硫酸銨沉淀樣品沉淀后的捕獲步驟或在離子交換層析后直接進(jìn)行中度純化步驟。

5.反相層析技術(shù)

用反相層析分離生物分子依賴于洗脫液中樣品分子和介質(zhì)可逆的疏水相互作用。起始條件主要是水相的，有利于高度有序的水結(jié)構(gòu)圍繞著樣品分子。通常的，一小部分有機(jī)修飾劑，通常是3%-5%的乙腈用來造成“濕”表面。樣品結(jié)合到填料上，暴露給洗脫液的疏水區(qū)域小化了。

分離依賴于樣品分子在洗脫液中和填料表面達(dá)到的平衡。樣品的分布依賴于填料的性質(zhì)，樣品的疏水性，洗脫液的組成（流動相）。起初，條件有助于100%樣品都結(jié)合在柱子上的極端平衡。由于蛋白和肽都有一些可及疏水和親水氨基酸，而且相對的大，它們和填料的相互作用具有多點接觸的性質(zhì)。

特點：反相層析可以在活力和四級結(jié)構(gòu)回收不重要的情況下，對于復(fù)雜混合物給出極高的分辨率的分析性分離。反相層析有高分辨純化的能力，也具有低分辨脫鹽的能力。在純化步驟中，當(dāng)在大部分雜質(zhì)已經(jīng)被除去，而需要高分辨的分離相似組分時，反相層析適合精細(xì)純化階段。

6.高效液相層析（HPLC）

在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進(jìn)氣相層析的理論而發(fā)展起來的一項新穎快速的分離技術(shù)。具有分離能力強(qiáng)、測定靈敏度高、可在室溫下進(jìn)行、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，對分離蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂等尤其有利，根據(jù)流動相和固定相相對極性，高效液相色譜分析可分為正相和反相兩種。

特點：用高壓輸液泵，壓強(qiáng)可達(dá)5000psi（相當(dāng)于34個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓）。用直徑約3～10微米的超細(xì)支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一層1～2微米的二氧化硅，經(jīng)硫酰氯反應(yīng)生成Si—Cl，進(jìn)一步連接疏水的烷基，如Si—C18H37，或陽離子交換基團(tuán)—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或陰離子交換基團(tuán)—Si（CH2）nNH2。這種支持物能承受很高的壓力，化學(xué)性能穩(wěn)定。用不同類型支持物的HPLC，可做吸附層析、離子交換層析和凝膠過濾層析。其分析微量化可達(dá)10-10克水平。但用于制備，可以純化上克的樣品。展層時間短，一般需幾分鐘到10余分鐘。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適于分析分離不揮發(fā)和極性物質(zhì)。而氣相層析只適用于揮發(fā)性物質(zhì)，兩者互為補(bǔ)充，都是目前為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數(shù)據(jù)處理的積分儀和記錄儀等電子系統(tǒng)，成為一種先進(jìn)的分析儀器，在生物化學(xué)、化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和環(huán)境科學(xué)的研究中發(fā)揮了重要作用。

7.吸附層析

指混合物隨流動相通過固定相時，由于吸附劑對不同物質(zhì)的不同吸附力，而使混合物分離的方法。它是各種層析技術(shù)中應(yīng)用早的一類，至今仍廣泛應(yīng)用于各種天然化合物和微生物發(fā)酵產(chǎn)品的分離、制備。

吸附層析可以是薄層層析，也可以是柱層析——即蛋白純化系統(tǒng)使用的純化方式。硅膠通常用于薄層層析——將不同顆粒度的硅膠用水調(diào)成糊狀鋪于玻璃板上，后經(jīng)高溫烘干。硅膠也可用于柱層析。硅膠主要是用于疏水性物質(zhì)的分離，在蛋白質(zhì)化學(xué)中不常使用，但可以用于小分子多肽的分離和分析。磷酸鈣凝膠與硅膠相反，基本上只用于柱層析，主要用于蛋白質(zhì)等大分子的分離，對某些酶類的分離呈現(xiàn)很好的效果。

特點：吸附層析常用于濃縮樣品。一些濃度很稀的樣品，在特定的條件下吸附在層析柱上，而后突然地改變條件，將被吸附的樣品一起從吸附柱上洗脫下來，這樣所得的樣品的濃度可以提高很多。

8.分配層析技術(shù)

各物質(zhì)在兩相中擴(kuò)散速度不同，產(chǎn)生不同的分配系數(shù)。分配層析分離技術(shù)是利用各物質(zhì)不同分配系數(shù)，使混合物隨流動相通過固定相時而予以分離的方法。分配層析中應(yīng)用廣泛的是以濾紙為多孔支持物的紙上分配層析。其次是以硅膠、硅藻土、纖維素粉、淀粉、微孔聚乙烯粉等多孔支持物的分配層析。還有直接使物質(zhì)在兩種不相溶的溶劑中進(jìn)行分配的常壓液相分配層析和高壓液相分配層析。分配層析以分配系數(shù)為依據(jù)，在等溫等壓條件下可用下式表示。K=K2/K1，式中K為分配系數(shù);K2是物質(zhì)在固定相中的濃度; K1是物質(zhì)在流動相中的濃度。分配系數(shù)與溫度、溶質(zhì)和溶劑的性質(zhì)有關(guān)，各種物質(zhì)有不同的分配系數(shù)。

特點：分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中的溶解達(dá)到平衡時，該溶質(zhì)在兩相溶劑中所具濃度的比例。不同物質(zhì)因其性質(zhì)不同而有不同的比例，也就是有不同的分配系數(shù)?，F(xiàn)在應(yīng)用的分配層析技術(shù)，大多數(shù)是以一種多孔物質(zhì)吸著一種極性溶劑，此極性溶劑在層析過程中始終固定在此多孔支持物上而被稱為固定相。另用一種與固定相不相溶的非極性溶劑流過固定相，此移動溶劑稱為流動相。如果有多種物質(zhì)存在于固定相和流動相之間，將隨著流動相的移動進(jìn)行連續(xù)的、動態(tài)的不斷分配，由于各種物質(zhì)的分配系數(shù)相近，移動距離就必須相當(dāng)長才能分開。反之，兩種物質(zhì)的分配系數(shù)相差越大，彼此分開時的移動距離就越短。因此，必須根據(jù)實際情況，選定作為固定相用的層析柱或濾紙的長度。

9.鰲合層析

在生物分子中親水的部位也經(jīng)?？梢员舜诵纬蓺滏I和其他配位鍵，鰲合層析就是基于這個原理。在一些基質(zhì)上接有亞氨基二乙酸等具有配位能力的分子，這樣的介質(zhì)就能螯合鋅、銅、鐵等離子，而這些離子的配位價還未飽和，為此離子還可以與蛋白質(zhì)等生物分子形成配位鍵。不同生物分子形成的配位鍵的強(qiáng)度各異，從而可起到分離純化作用。

、特點：這類層析不僅可以分離純化轉(zhuǎn)鐵蛋白和銅鹽蛋白等含有金屬的蛋白質(zhì)，也可分離不含金屬的蛋白。

結(jié)語

蛋白純化過程受蛋白本身理化性質(zhì)影響，技術(shù)人員理論及經(jīng)驗很大程度上也決定了純化成功與否，實際操作中可根據(jù)實驗需求及實驗室具備的條件選擇合適的純化方法。