有前景的肝癌治療靶點(diǎn)

本研究中，研究結(jié)果表明，circIPP2A2下調(diào)在體外和體內(nèi)抑制HCC的腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。具體來(lái)說(shuō)，本研究發(fā)現(xiàn)，在N7-甲基鳥(niǎo)苷酸修飾的調(diào)控下，circIPP2A2作為調(diào)節(jié)Hornerin/PI3K/AKT/GSK3β軸的分子支架，促進(jìn)了HCC的惡性行為。靶向circIPP2A2可能是治療HCC患者的一種有前途的策略。
背景信息
01
肝細(xì)胞癌（HCC）是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。2020年全球約有91萬(wàn)新發(fā)病例和83萬(wàn)死亡病例。其中一半發(fā)生在中國(guó)，因?yàn)橐腋尾《靖腥镜母甙l(fā)率。盡管治療策略得到了發(fā)展，新型治療靶點(diǎn)也出現(xiàn)了，但由于缺乏早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)的標(biāo)記物，HCC患者的預(yù)后仍然不樂(lè)觀。因此，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物并了解HCC的調(diào)控機(jī)制對(duì)患者具有重要的臨床益處。
m7G是人類常見(jiàn)的RNA修飾之一，由METTL1-WDR4復(fù)合體調(diào)控。METTL1是負(fù)責(zé)m7G形成的催化酶，而WDR4在穩(wěn)定m7G復(fù)合物中起關(guān)鍵作用。近年來(lái)的研究表明，m7G修飾與人類生物學(xué)過(guò)程和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。例如，mettl1介導(dǎo)的m7G修飾通過(guò)破壞初級(jí)miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)增強(qiáng)let-7 miRNA的加工，這可能是RNA修飾調(diào)控miRNA結(jié)構(gòu)的新見(jiàn)解。在肝癌中，研究人員發(fā)現(xiàn)mettl1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾通過(guò)促進(jìn)EGFR翻譯而促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌進(jìn)展。這些結(jié)果提示METTL1介導(dǎo)的m7G修飾與疾病的發(fā)生和進(jìn)展存在相關(guān)性。然而，m7g修飾的circRNAs的作用機(jī)制仍有待揭示。
關(guān)于circIPP2A2表達(dá)的新見(jiàn)解
02
研究人員利用慢病毒載體建立了兩個(gè)circIPP2A2穩(wěn)定敲低的肝癌細(xì)胞株（hep3b - shcircipp2a2# 1、#2、#3和hcclm3 - shcircipp2a2# 1、#2、#3），然后研究人員選擇#2和#3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)研究。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低circIPP2A2表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circIPP2A2表達(dá)下調(diào)具有抑制肝癌細(xì)胞克隆形成能力的潛能。研究人員通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了circIPP2A2對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circIPP2A2表達(dá)下調(diào)抑制了肝癌細(xì)胞的遷移。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低circIPP2A2表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。circIPP2A2表達(dá)下調(diào)可抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。
下調(diào)circIPP2A2表達(dá)可抑制肝癌的體內(nèi)外惡性生物學(xué)行為
隨后，研究人員采用小鼠模型研究體內(nèi)抑制circIPP2A2表達(dá)引起的腫瘤抑制效果。研究結(jié)果表明，沉默circIPP2A2表達(dá)可抑制肝癌肺轉(zhuǎn)移。HE染色證實(shí)肺轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。研究人員通過(guò)皮下注射Hep3B細(xì)胞株建立細(xì)胞源性異種移植（CDX）模型。結(jié)果顯示，circIPP2A2下調(diào)抑制了腫瘤生長(zhǎng)，導(dǎo)致了更低的腫瘤負(fù)荷。綜上所述，這些結(jié)果證明了circIPP2A2的下調(diào)在體外和體內(nèi)都抑制了肝癌的惡性行為。
促進(jìn)HCC發(fā)生或進(jìn)展的新機(jī)制
03
為了鑒定參與circIPP2A2 m7G修飾的蛋白及其與RNA分子的相互作用，研究人員使用靶向METTL1和WDR4的抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。尤其是，研究人員使用qPCR鑒定了METTL1與circIPP2A2的序列具有親和力，而不是WDR4。隨后的蛋白質(zhì)印跡法和qPCR檢測(cè)顯示，在穩(wěn)定敲低circIPP2A2的細(xì)胞株中，METTL1的mRNA和蛋白水平?jīng)]有變化。而且，通過(guò)使用sirna沉默METTL1的表達(dá)，qPCR結(jié)果表明，METTL1的下調(diào)能夠抑制circIPP2A2的表達(dá)，但線性IPP2A2的表達(dá)保持不變。因此，以上結(jié)果確定了METTL1是circIPP2A2的上游調(diào)控因子。
考慮到m7G修飾在癌癥發(fā)生發(fā)展中的重要作用，研究人員利用在線生物信息學(xué)工具iRNA-m7G數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)circIPP2A2中潛在的m7G修飾位點(diǎn)。根據(jù)iRNA-m7G數(shù)據(jù)庫(kù)，circIPP2A2的大部分m7G位點(diǎn)位于+ 545-683區(qū)域。研究人員采用抗m7G抗體m7G- merip實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circIPP2A2的m7G修飾位點(diǎn)。m7G- merip - qpcr結(jié)果顯示，抗m7G可捕獲circIPP2A2的潛在m7G修飾區(qū)域，沉默METTL1表達(dá)降低了circIPP2A2的m7G富集。先前的研究表明，m7G修飾具有增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性和促進(jìn)翻譯的潛力。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，研究人員對(duì)circIPP2A2的穩(wěn)定性進(jìn)行了檢驗(yàn)。研究表明m7G修飾增強(qiáng)了circIPP2A2的穩(wěn)定性。此外，沉默METTL1的表達(dá)導(dǎo)致circIPP2A2降低角蛋白的富集。研究結(jié)果還表明，在HCC中，角蛋白和circIPP2A2的m7g修飾區(qū)域（+ 545-683）之間存在強(qiáng)烈的相互作用。以上結(jié)果表明，circIPP2A2受mettl1介導(dǎo)的m7G修飾調(diào)控，circIPP2A2區(qū)域內(nèi)的m7G修飾在促進(jìn)角蛋白結(jié)合中起關(guān)鍵作用，可能促進(jìn)HCC的發(fā)生或進(jìn)展。
總結(jié)
04
本研究建立在前期的研究基礎(chǔ)上，即角蛋白在肝細(xì)胞癌中調(diào)節(jié)AKT信號(hào)通路。本研究結(jié)果表明，circIPP2A2通過(guò)mettl1介導(dǎo)的m7G修飾來(lái)促進(jìn)角蛋白和PI3K的相互作用，從而調(diào)節(jié)AKT/GSK3β信號(hào)通路。CircIPP2A2可能作為肝細(xì)胞癌患者術(shù)后監(jiān)測(cè)和治療干預(yù)的腫瘤標(biāo)志物。