視網(wǎng)膜光損傷凋亡機(jī)制研究進(jìn)展報告

【關(guān)鍵詞】  視網(wǎng)膜光損傷 凋亡機(jī)制 光感受器 研究進(jìn)展
    光對視網(wǎng)膜的損傷包括熱灼傷、光化學(xué)損傷和機(jī)械損傷三種方式。因為眼內(nèi)組織色素分布的差異，藍(lán)光主要在神經(jīng)上皮層吸收，主要引起視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷；綠光在神經(jīng)上皮和色素上皮的吸收相近；黃光主要在色素上皮和脈絡(luò)膜淺層被吸收；紅光則作用得更深，主要引起熱效應(yīng)；而高能量的激光可以引起機(jī)械損傷。凋亡是視網(wǎng)膜細(xì)胞光損傷的主要結(jié)果之一，氧化損傷、鈣穩(wěn)態(tài)失衡和線粒體損傷在凋亡過程中起著不同的作用。
    1  氧化損傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡
    視網(wǎng)膜光損傷的主要損傷部位通常是在光感受器［1］，但也有研究認(rèn)為主要損傷在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、Muller細(xì)胞及視網(wǎng)膜全層的線粒體［2］。視網(wǎng)膜細(xì)胞尤其是光感受器細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞代謝活躍，又處于富氧環(huán)境中，適當(dāng)頻率的光子和氧分子在視網(wǎng)膜外層可發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，生成活性氧產(chǎn)物?；ㄉ南┧崾羌?xì)胞膜中的一種不飽和脂肪酸，在活性氧作用下可不經(jīng)環(huán)氧化酶作用而生成過氧化產(chǎn)物isoprostane， Tzvete Dentchev等［3］在對Balb/c小鼠視網(wǎng)膜提取物的檢測結(jié)果顯示，伴隨光損傷程度加重相應(yīng)的isoprostane 異構(gòu)體F2α-VI含量的明顯升高，這與以往對其它氧化指標(biāo)的研究結(jié)果相符。細(xì)胞膜構(gòu)成物質(zhì)的破壞可導(dǎo)致其通透性的上升，使膜兩側(cè)各種物質(zhì)如鈣離子，鈉鉀離子的平衡狀態(tài)發(fā)生改變，觸發(fā)凋亡，嚴(yán)重的可以直接引起細(xì)胞死亡。
    鹿慶等［4］利用次黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生氧自由基來處理牛RPE細(xì)胞，證實氧化損傷后出現(xiàn)了細(xì)胞DNA的破壞。一般認(rèn)為，基因發(fā)生異常后由野生型P53基因編碼的P53蛋白在細(xì)胞周期的G1期發(fā)揮檢查點功能，一旦發(fā)現(xiàn)有缺陷的DNA，它就啟動DNA修復(fù)機(jī)制，如果修復(fù)失敗，則通過直接激活bax凋亡基因或下調(diào)bcl-2抗凋亡基因的表達(dá)而誘導(dǎo)凋亡。但是，Marti A與Hafezi F［5］等通過對P53基因缺失的c57小鼠的研究發(fā)現(xiàn),P53缺失與P53不缺失小鼠的光感受器細(xì)胞在細(xì)胞凋亡,結(jié)構(gòu)改變及功能損傷等方面都無顯著性差異。推測可能與光感受器細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯特性有關(guān)，在凋亡過程中可能由其它基因起著作用。
    NF-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞胞漿中的轉(zhuǎn)錄因子，它可被氧化劑和紫外線等多種細(xì)胞外刺激激活。激活后的NF-κB與其抑制蛋白IκB解離，然后自胞漿進(jìn)入胞核與靶序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。將培養(yǎng)的鼠感光細(xì)胞暴露于4.5 mw/mm的可見光后，細(xì)胞可出現(xiàn)凋亡及時間依賴的NF- κB水平降低。光感受器細(xì)胞經(jīng)顯性負(fù)突變型IκB a 轉(zhuǎn)染后，伴隨NF- κB水平的明顯下調(diào)光感受器細(xì)胞凋亡也加速［6］。提示NF-κB Rel 亞單位在核內(nèi)的存在，對于保護(hù)光感受器細(xì)胞免受光誘導(dǎo)的凋亡具有重要的作用。
    另外，氧化應(yīng)激可改變細(xì)胞膜的通透性使Ca2+內(nèi)流增加， Ballinger等［7］的研究表明，慢性的、低水平的ROI(reactive oxygen intermediates)持續(xù)存在將通過線粒體DNA的損傷啟動視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的功能障礙。
    2  鈣穩(wěn)態(tài)失衡與視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡
    以往的研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)細(xì)胞凋亡過程中，胞內(nèi)Ca2+濃度有所增加，而鈣釋放通道是細(xì)胞內(nèi)鈣增加的主要來源。Edward DP［8］和Li［9］等分別使用氟桂利嗪（flunarizine）和尼莫地平（Nimodipine）治療實驗性大鼠視網(wǎng)膜光損傷，結(jié)果證明前者損傷減輕而后者無效，提示內(nèi)鈣的釋放才是胞內(nèi)Ca2+濃度升高的主要原因。1，4，5-三磷酸肌醇受體（IP3R）主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），外界的刺激作用于細(xì)胞，通過G蛋白偶聯(lián)受體激活PLC，水解PIP2產(chǎn)生IP3和DG，IP3與受體結(jié)合觸發(fā)內(nèi)鈣釋放。胞膜鈣通道受刺激可引起Ca2+內(nèi)流，Ca2+是IP3對IP3R的共同激動劑，又可通過鈣調(diào)素（CaM）而抑制IP3R介導(dǎo)的Ca2+釋放。也有研究認(rèn)為維拉帕米（Verapamil）能誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞的凋亡，可能是通過caspase-3途徑起作用［10］。一般認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放是觸發(fā)環(huán)節(jié)，而細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度在高水平維持需要細(xì)胞膜鈣通道的持續(xù)作用。
    Ca2+濃度升高引起的其他改變：AP-1 因子如c-fos、jun兩大類核磷酸蛋白，與感光細(xì)胞的許多生理周期的調(diào)節(jié)有關(guān)：如感光細(xì)胞膜盤的脫落，感光細(xì)胞特異性基因的表達(dá)(如視紫質(zhì)、轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)。在Ca2+濃度升高能夠刺激fos 和jun 蛋白形成復(fù)合體，這些復(fù)合體與特異性的DNA 序列結(jié)合而發(fā)揮作用。張躍紅等［11］的實驗顯示在光照后6 h,外核層可觀察到大量c-fos陽性表達(dá),且該時段陽性細(xì)胞數(shù)多，光照后12 h和36 h,仍可見陽性表達(dá),但呈現(xiàn)出逐漸遞減的趨勢。Hafezi等［12］的研究表明 c-fos 缺乏能抑制光誘導(dǎo)的感光細(xì)胞凋亡。Calpains是一類特異性依鈣激活的中性半胱氨酸酶，在細(xì)胞骨架的重建、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和信號傳導(dǎo)中起著重要作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度超過一定的值時, Calpain激活成活性形式,使底物發(fā)生降解，發(fā)生凋亡［13］。劉凱,等：視網(wǎng)膜光損傷凋亡機(jī)制研究進(jìn)展遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報  2008年4月，29(2)
    另外,Ca2+可激活一氧化氮合酶(NOS)，使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變成黃嘌呤氧化酶,導(dǎo)致氧自由基的形成,氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化又可造成大量的Ca2+內(nèi)流,進(jìn)一步加重光損傷的程度。
    3  線粒體損傷與視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡
    線粒體是細(xì)胞的能量工廠，在細(xì)胞凋亡期間盡管線粒體仍能維持其超微結(jié)構(gòu)的基本正常，但事實上其功能已發(fā)生顯著改變，如：線粒體內(nèi)膜通透性增大，線粒體內(nèi)膜的跨膜電位下降，能量合成水平顯著降低等。ATP的代謝異常會引發(fā)一系列的離子泵功能障礙，且線粒體的三羧酸循環(huán)或呼吸鏈功能受抑制即可引起細(xì)胞凋亡。線粒體膜的通透性一般認(rèn)為與內(nèi)外膜之間的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)有關(guān)。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(mitochondrial permeability transition, MPT) 和MPTP的開放可能是引起細(xì)胞凋亡的原因［14］。線粒體膜通透性增大，使細(xì)胞凋亡的啟動因子如：細(xì)胞色素C，凋亡蛋白酶激活因子Apaf和凋亡誘導(dǎo)因子AIF等從線粒體內(nèi)釋放出來。細(xì)胞色素C 再進(jìn)一步與Apaf-1 結(jié)合后,經(jīng)一系列凋亡蛋白酶參與的反應(yīng)終作用于底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15］。已經(jīng)在體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞經(jīng)藍(lán)光損傷后觀察到與線粒體膜電位降低、細(xì)胞色素C釋放相關(guān)的凋亡現(xiàn)象［16］。而在凋亡的細(xì)胞色素C途徑上，可能存在著“分子制動器”類的核甘酸［17］，即線粒體受刺激釋放的細(xì)胞色素C是微不足道的，必須持續(xù)釋放大量的細(xì)胞色素C才能克服分子制動器的作用才能引起凋亡。然而在視網(wǎng)膜細(xì)胞光損傷中，這類核甘酸的存在是否有意義仍然未知。
    4  目前光損傷理論在臨床上的研究及應(yīng)用
    關(guān)于白內(nèi)障手術(shù)和老年性黃斑變性(AMD) 的相關(guān)性研究已有很多。Taylor［18］的研究發(fā)現(xiàn),藍(lán)光與AMD發(fā)展到視覺缺失的過程有明顯的相關(guān)性。白內(nèi)障摘除后藍(lán)光對視網(wǎng)膜的損傷,可能是加速AMD 發(fā)展的原因之一［19］。白內(nèi)障術(shù)后人工晶體眼將過多的暴露在藍(lán)光下，可濾過藍(lán)光的人工晶體能對視網(wǎng)膜起到更多的保護(hù)作用。近年來也有采用視網(wǎng)膜移植的方法來治療光性損傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜光感受器的退行性變性的研究，但其操作難度較大，而且長期效果也有待觀察。
    經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?TTT) 采用的紅外激光將熱能通過瞳孔輸送到脈絡(luò)膜和色素上皮,以達(dá)到溫?zé)嶂委熝鄣撞∽兊哪康?。目前已逐漸應(yīng)用于治療老年黃斑變性( age-related macular degeneration,AMD) 等眼底疾病，隨著TTT 激光能量增加, 視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)腫脹、變性甚至壞死。細(xì)胞凋亡逐漸累及內(nèi)顆粒層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層［20］。過量的 TTT治療可以顯著地誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生,閾能級TTT照射不引起神經(jīng)節(jié)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，較安全，其作用機(jī)制以細(xì)胞凋亡為主［21］。
    小結(jié)  在視網(wǎng)膜光損傷的凋亡過程中，氧化損傷、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體損傷三方面在凋亡的發(fā)生上即可單獨啟動，又表現(xiàn)出復(fù)雜的交互作用，這三種機(jī)制互相聯(lián)系，互為因果。借助于基礎(chǔ)理論研究的深入，對控制光損傷視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的研究取得了一定進(jìn)展，但是臨床上針對存在視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡疾病如AMD，缺血再灌注損傷等的基本治療方法仍以維生素類及抗氧化劑為主，但對光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的根本機(jī)制仍不清楚，能否大程度的對某一環(huán)節(jié)進(jìn)行針對性的研究，如進(jìn)一步控制氧化水平，鈣通道的狀態(tài)和線粒體相關(guān)的凋亡途徑，有望在光損傷視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的防治中起到更大作用。
【參考文獻(xiàn)】
  　［1］Szczesny P J， Walther P， Muller M. Light damage in rod outer segments : The effects of fixation on ultrastructural alterations［J］. Curr Eye Res，1996，15(8) :807 - 814.

　?。?］Van Best J A， Putting B J， Oosterhuis J A， et al. Function and morphology of the retinal pigment epithelium after light-induced damage［J］. Microsc Res Tech，1997，36(2) :77 - 88.

　?。?］Tzvete Dentchev, Yuemang Yao, Domenico Praticó, et al. Isoprostane F2α-VI, a new marker of oxidative stress, increases following light damage to the mouse retina［J］.Molecular Vision,2007,13:190-195.

　?。?］鹿慶,孫葆忱,王津津.人參皂甙Rg1、Rb1 和維生素E 對氧化損傷的牛RPE細(xì)胞凋亡的影響［J］.眼科新進(jìn)展，1999，19（3）：152-154.

　?。?］Lansel,Nicola, Hafezi, et al. The mouse ERG before and after light damage is independent of p53［J］. Documenta Ophthalmologica，1999, 96(4): 311-320.

　?。?］Krishnanoorthy RR,Crawford MJ, chaturvedi MM, et al. Photo-oxidative stress down-modulates the activity of muclear factor-kappa B Via involvement of caspase-1, leading to apoptosis of photoreceptor cells ［J］. J Biol Chem,1999,274(6):3734-3743.

　　［7］Ballinger SW， Van Houten B, Jin GF, Conklin CA， et al. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells ［J］. Exp Eye Res，1999，68: 765-772.

　　［8］Edward DP， Lam TT， Shahinfar S， et al. Amelioration of light-induced retinal degeneration by a calcium overload blocker ［J］. Flunarizine Arch Ophthalmol， 1991,109(4):554-562.

　?。?］Li J, Edward DP, Lam TT, et al.Nimodipine, a voltage-sensitive calcium channel antagonist, fails to ameliorate light-induced retinal degeneration in rat ［J］.Res Commun Chem Pathd Pharmacol,1991，72(3):347-352.

　?。?0］龐東渤,洪晶.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡途徑的研究［J］.眼科新進(jìn)展, 2007，27(6)： 405-407.

　?。?1］張躍紅,牛膺筠,王紅云,等.低氧預(yù)適應(yīng)對小鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞光損傷的防護(hù)作用［J］.中華眼科雜志，2005，41(7)：631-635.

　?。?2］Hafezi F,Steinbach JP,Marti A，et al. The absence of c-fos prevents light-induced apoptotic cell death of photoreceptors in retinal degeneration in vivo［J］. Natl Med,1997，3(3)，346-349.

　?。?3］Mellgren RL, Nettey MS, Mericle MT, et al.An improved purification procedure for Calpastatin, the inhibitor protein specific for the intracellular calcium-dependent proteases, calpain ［J］.Biochem,1988,18∶183-197.

　?。?4］Hansson MJ, Persson T, Friberg H, et al. Powerful cyclosporine inhibition of calcium-induced permeability transition in brain mitochondria［J］. Brain Res, 2003, 960: 99-111.

　?。?5］邱觀婷,唐仕波.視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡與保護(hù)［J］. 國外醫(yī)學(xué)眼科學(xué)分冊,1999，23(5)：291-295.

　?。?6］蔡善君,嚴(yán)密,毛詠秋,等. 藍(lán)光致人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡與線粒體膜電位和細(xì)胞色素C的關(guān)系［J］.中華眼科雜志, 2006，42(12)：1095-1102.

　?。?7］馬洪明.科學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的分子制動器［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志, 2006，86(32)：2270.

　?。?8］Taylor HR. The long - term effects of visible light on the eye ［J ］. Arch phthalmol，1992， 110 : 99 - 104.

　?。?9］樓定華,童劍平,許葉圣,等.濾藍(lán)光人工晶體的臨床觀察［J］.中國實用眼科雜志, 2005，23(9)：955 - 957.

　?。?0］周瓊,李恩輝,劉永琰,等.不同激光強度經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼▽ι赝靡暰W(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響［J］.中華眼底病雜志，2006，22(4 )：249-252.

　?。?1］陳麗娟,曹西友,苗林.兔眼經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼ㄩ撝的芰恐委煹慕M織病理反應(yīng)和細(xì)胞凋亡［J］.國際眼科雜志, 2007，7(4)：993-996.