聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞遺傳學(xué)、巢式RTPCR和FISH技術(shù)檢測(cè)慢

作者：王慧萍　李國(guó)霞　,喬振華　,王宏偉　　作者單位：1山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科，太原 030001; 2上海交通大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200080

　　【摘要】本研究探討常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)(conventional cytogenetics, CC)、巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(nestedreverse transc[x]riptase polymerase chain reaction, nestedRTPCR)及雙色雙融合熒光原位雜交(dualcolor and dualfusion fluorescence in situ hybridization, DFISH) 三種技術(shù)監(jiān)測(cè)慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)患者造血干細(xì)胞移植治療過(guò)程中腫瘤負(fù)荷的靈敏度和特異性。聯(lián)合應(yīng)用CC、巢式RTPCR 和DFISH三種技術(shù)對(duì)7例CML患者非清髓性異基因干細(xì)胞移植治療前后的腫瘤負(fù)荷水平進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示： 7例CML患者治療前后的40份骨髓標(biāo)本中，有29份標(biāo)本檢出不同比率的Ph染色體;3份因細(xì)胞數(shù)少CC分析失敗;36份標(biāo)本RTPCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。病例1移植后12、18、26及38個(gè)月的4份標(biāo)本Ph染色體及RTPCR結(jié)果均為陰性。病例1移植后9、10個(gè)月、病例2移植后15個(gè)月、病例3移植后12個(gè)月的4份Ph(-)bcr/abl(+)標(biāo)本經(jīng)FISH檢測(cè)，分別檢出5.4%、 0%、 16.5%及1.5%的bcr/abl(+)細(xì)胞。病例5移植后20、60天、病例7移植后40天的3份標(biāo)本因細(xì)胞數(shù)少而CC核型分析失敗，對(duì)其行FISH檢測(cè)，結(jié)果bcr/abl(+)細(xì)胞檢出率分別為55.0%、27.5%和73.5%。病例1移植后12個(gè)月Ph(-)bcr/abl(-)的標(biāo)本行FISH檢測(cè)，結(jié)果bcr/abl(+)細(xì)胞檢出率為0%。結(jié)論： CC可作為監(jiān)測(cè)CML患者治療過(guò)程中腫瘤負(fù)荷水平的基本手段。在移植后早期細(xì)胞數(shù)太少而無(wú)法進(jìn)行CC檢測(cè)，以及治療病人體內(nèi)腫瘤負(fù)荷降低到CC不能檢出而RTPCR仍為陽(yáng)性時(shí)，借助FISH準(zhǔn)確檢測(cè)體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，以監(jiān)測(cè)其動(dòng)態(tài)變化。FISH檢測(cè)bcr/abl轉(zhuǎn)陰的病人需靠靈敏度更高的RTPCR監(jiān)測(cè)核定。

　　【關(guān)鍵詞】 慢性髓系白血病;細(xì)胞遺傳學(xué);聚合酶鏈反應(yīng);熒光原位雜交

　　Detection of Tumor Load in Chronic Myeloid Leukemia During Treatment with Transplantation by Conventional Cytogenetics, NestedRTPCR and FISH WANG HuiPing1,2 ,LI GuoXia1, QIAO ZhenHua1, WANG HongWei1 1Department of Hematology, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China;2Central Experimental Laboratory, The First People Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080，China

　　Abstract This study was purposed to investigate the sensitivity and specificity of conventional cytogenetics (CC),nestedreverse transc[x]riptase polymerase chain reaction (nestedRTPCR) and dualcolor / dualfusion fluorescence in situ hybridization (DFISH) technique in monitoring the tumor load of chronic myeloid leukemia (CML) during treatment with transplantation. CC, nestedRTPCR and interphase DFISH were simultaneously carried out to detect the tumor load of 7 CML patients during treatment with nonmyeloablative allogentic stem cell transplantation(alloNSCT).40 specimens from 7 CML patients before and after alloNSCT were analyzed. The results showed that 29 specimens were Ph(+) with different positive ratio and 3 specimens with lower cells were not analyzed by CC. 36 specimens were bcr/abl mRNA (+) by RTPCR. 4 specimens from case 1 at 12，18，26 and 38 months after alloNSCT were Ph(-) and bcr/abl mRNA (-),4 Ph(-)bcr/abl(+) specimens containing 2 from case 1 at 9 and 10 months after alloNSCT, 1 from case 2 at 15 months after alloNSCT, 1 from case 3 at 12 months after alloNSCT showed 5.4%, 0%, 16.5% and 1.5% bcr/abl(+) cells by FISH. 3 specimens with lower cells containing 2 from case 5 at 20 and 60 days after alloNSCT and 1 from case 7 at 40 days after alloNSCT were analyzed by FISH and showed 55.0%, 27.5% and 73.5% bcr/abl(+) cells. The Ph (-) bcr/abl(-) specimen from case 1 at 12 monthss postalloNSCT showed 0% bcr/abl (+) cells by FISH. It is concluded that CC can be used as a basic tool to monitor the change of tumor load in CML during treatment. When specimen with lower cells can not be analyzed by CC in early period after alloNSCT, or result of CC can not evaluate precisely dynamic change of tumor load and when tumor load in treated patient are lower to Ph(-) by CC while bcr/abl mRNA (+) by RTPCR, FISH must be used to detect precisely tumor load and monitor dynamic change of it. More sensitive RTPCR is used to monitor tumor load when it is lower to bcr/abl(-) by FISH during treatment.

　　Key words chronic myeloid leukemia; cytogenetics;　 polymerase chain reaction; fluorescence in situ hybridization

　　J Exp Hematol 2007; 15(2):-

　　Ph染色體是慢性髓系白血病(CML)的標(biāo)志染色體，其本質(zhì)是t(9;22)(q34;q11)易位，易位的結(jié)果使位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)4帶 (q34) 上的cabl原癌基因與22號(hào)染色體長(zhǎng)臂上一個(gè)功能未明的斷裂點(diǎn)簇集區(qū)(breakpoint cluster region, BCR)發(fā)生拼接，形成bcr/abl融合基因。易位形成的Ph染色體及相應(yīng)的bcr/abl融合基因是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)，也是CML的惡性克隆標(biāo)志。在評(píng)價(jià)CML對(duì)各種治療如INFα、骨髓移植、格列衛(wèi)等的反應(yīng)程度時(shí)，準(zhǔn)確判斷患者骨髓細(xì)胞中的腫瘤負(fù)荷十分重要。我們聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)(CC)、巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(nestedRTPCR)及雙色雙融合熒光原位雜交(DFISH)技術(shù)對(duì)7例非清髓性異基因干細(xì)胞移植治療的CML患者的腫瘤負(fù)荷水平進(jìn)行檢測(cè)，探討3種技術(shù)對(duì)監(jiān)測(cè)CML患者治療過(guò)程中腫瘤負(fù)荷的靈敏度和特異性。

　　病例

　　7例CML患者系我院血液科2001年9月-2005年1月就診的住院病人,均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男性5例,女性2例，年齡19-56歲，中位年齡38歲。7例患者均行非清髓性異基因干細(xì)胞移植，術(shù)后根據(jù)臨床反應(yīng)及嵌和體形成情況給予供體淋巴細(xì)胞輸注。陰性對(duì)照為3例健康供體骨髓細(xì)胞,陽(yáng)性對(duì)照為K562細(xì)胞。

　　常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析

　　采用骨髓直接法和(或)24小時(shí)短期培養(yǎng)法按常規(guī)制備染色體并進(jìn)行R顯帶核型分析。染色體核型異常按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN)》(1995)進(jìn)行描述,每份標(biāo)本至少分析10個(gè)中期細(xì)胞。

　　bcr/abl融合基因轉(zhuǎn)錄本的巢式RTPCR檢測(cè)

　　巢式RTPCR按我室常規(guī)方法進(jìn)行。外測(cè)引物序列為：C:5′GCTTCTCCCTGACATCCGTG3′，D:5′CGAGCGGCTTCACTCAGACC3′內(nèi)測(cè)引物序列為：A:5′CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG3′，B:5′CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA3′，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，只有陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性，陰性對(duì)照為陰性時(shí)結(jié)果才視為可靠。

　　bcr/abl融合基因的DFISH法檢測(cè)[1]

　　bcr/abl融合基因探針 LSI BCRABL DFISH探針由美國(guó)Vysis公司提供。

　　FISH檢測(cè) 取出保存于 -20℃的染色體標(biāo)本,換上新鮮固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)滴片, 室溫氣干后放入37℃預(yù)溫的2×SSC中30分鐘，分別在70%、85%、的乙醇(體積比)中室溫梯度脫水,每梯度2分鐘, 晾干。 在73℃變性液(70%的甲酰胺/2×SSC)中變性5分鐘, 70%、85%、冰乙醇(-20℃)系列脫水, 每梯度2分鐘, 晾干備用。將1 μl混合探針與9 μl雜交稀釋液(hybridization buffer，購(gòu)自Vysis公司)混合,在73℃水浴中變性5分鐘, 然后加在染色體標(biāo)本上,蓋片封膠, 放入預(yù)熱的濕盒中, 37℃雜交過(guò)夜。雜交后標(biāo)本在73℃ 0.4×SSC/0.3% Triton100中洗滌2分鐘,再用2×SSC/0.1% Triyon100室溫洗滌1分鐘, 避光晾干后加10 μl二氨基酚吲哚(DAPI)復(fù)染標(biāo)本, 20分鐘后熒光顯微鏡檢測(cè)。

　　熒光顯微鏡檢查 在NikonE600熒光顯微鏡下通過(guò)三色濾光塊(DAPI/TRITC/FITC)觀察雜交信號(hào),每例至少分析200個(gè)間期細(xì)胞,不計(jì)數(shù)重疊細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比率。FISH結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):紅色(red, R)信號(hào)為abl,綠色(green, G)信號(hào)為bcr,將R信號(hào)與G信號(hào)重疊或接觸定義為融合信號(hào)(fusion, F), 融合信號(hào)在熒光顯微鏡下呈黃色，為bcr/abl或abl/bcr融合基因。具有典型t(9;22)易位的細(xì)胞顯示2個(gè)黃色的融合信號(hào)和1個(gè)紅色及1個(gè)綠色信號(hào)(2F1R1G),而正常細(xì)胞則顯示2個(gè)分離的紅色信號(hào)和2個(gè)分離的綠色信號(hào)(2R2G)。

　　結(jié) 果

　　正常分界值的確定

　　正常分界值的取值為正常對(duì)照組中所觀察到的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均值+3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(分界值=X+3SD)[1-3],陽(yáng)性細(xì)胞率大于分界值的標(biāo)本我們將其定義為異常。本研究陰性對(duì)照組DFISH檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞率為0%-0.5%,平均值0.17%,標(biāo)準(zhǔn)差0.24%,分界值為0.17%+3×0.24%=0.89%。K562細(xì)胞用DFISH重復(fù)2次檢測(cè),陽(yáng)性率為。

　　移植前后CC、RTPCR及FISH檢測(cè)結(jié)果

　　對(duì)來(lái)自7例CML患者非清髓性異基因干細(xì)胞移植治療前后的40份骨髓標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，其中29份標(biāo)本檢出有不同比率的Ph染色體，8份Ph染色體陰性,3份因細(xì)胞數(shù)少CC分析失敗。36份標(biāo)本RTPCR結(jié)果為陽(yáng)性，包括29份Ph(+)標(biāo)本、3份CC分析失敗標(biāo)本及4份Ph(-)標(biāo)本。病例1移植后12、18、26及38個(gè)月的4份標(biāo)本Ph染色體及RTPCR結(jié)果均為陰性。對(duì)來(lái)自病例1移植后9及10個(gè)月、病例2移植后15個(gè)月、病例3移植后12個(gè)月的4份Ph(-)bcr/abl(+)標(biāo)本進(jìn)一步行FISH檢測(cè)，分別檢出5.4%、0%、16.5及1.5%的bcr/abl(+)細(xì)胞。對(duì)病例5移植后20、60天和病例7移植后40天的3份因細(xì)胞數(shù)少即CC核型分析失敗的標(biāo)本行FISH檢測(cè)。bcr/abl(+)細(xì)胞檢出率分別為55.0%、27.5%和73.5%。對(duì)病例1移植后12個(gè)月Ph(-)bcr/abl(-)的標(biāo)本行FISH檢測(cè)，結(jié)果為bcr/abl(+)細(xì)胞檢出率為0%(附表)。

　　討 論

　　95%以上的CML具有t(9;22)(q34;p11)易位, 易位形成的Ph染色體及相應(yīng)的bcr/abl融合基因是CML發(fā)病的基礎(chǔ)。因此Ph染色體和bcr/abl融合基因是CML診斷、療效觀測(cè)和微小殘留病監(jiān)測(cè)的有效指標(biāo)。在評(píng)價(jià)CML對(duì)各種治療如INF、骨髓移植等的反應(yīng)程度時(shí)，從定量角度準(zhǔn)確判斷患者骨髓細(xì)胞中的腫瘤負(fù)荷有重要的臨床意義。研究表明[4],病人骨髓或造血干細(xì)胞移植后殘留腫瘤負(fù)荷的水平提示了疾病復(fù)發(fā)的可能性大小。目前進(jìn)行定量研究常用的檢測(cè)手段有CC、FISH和實(shí)時(shí)定量PCR等[5-7]。我們應(yīng)用這3種技術(shù)對(duì)7例非清髓性異基因干細(xì)胞移植治療中CML患者的腫瘤負(fù)荷水平進(jìn)行了檢測(cè)。

　　對(duì)7例CML患者非清髓性異基因干細(xì)胞移植治療前后的 40 份骨髓標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， 移植后早期(3個(gè)月)由于細(xì)胞數(shù)少，CC分析往往不敏感，甚至失敗。對(duì)病例5移植后20、60天、病例7移植后40天的3份因細(xì)胞數(shù)少CC核型分析失敗的標(biāo)本行FISH檢測(cè)，bcr/abl(+)細(xì)胞檢出率分別為55.0%、27.5%和73.5%，可見在移植后早期用FISH可以準(zhǔn)確檢測(cè)體內(nèi)腫瘤負(fù)荷水平，從而判定是否成功植入。移植后3個(gè)月至CC檢測(cè)Ph染色體轉(zhuǎn)陰前階段，可以用CC對(duì)體內(nèi)腫瘤負(fù)荷進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。當(dāng)應(yīng)用CC檢測(cè)Ph(-)而用RTPCR檢測(cè)bcr/abl(+)時(shí)，應(yīng)該用FISH監(jiān)測(cè)體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的動(dòng)態(tài)變化。我們對(duì)病例1移植后9、10個(gè)月、病例2移植后15個(gè)月、病例3移植后12個(gè)月的4份Ph(-)bcr/abl(+)標(biāo)本進(jìn)一步行FISH檢測(cè)，分別檢出5.4%、0%、16.5%及1.5%的bcr/abl(+)細(xì)胞，說(shuō)明CC檢測(cè)Ph轉(zhuǎn)陰后，體內(nèi)仍可能有一定數(shù)量的微小殘留病存在。病例1移植后10個(gè)月Ph(-)bcr/abl(+)標(biāo)本及移植后12個(gè)月Ph(-)bcr/abl(-)的標(biāo)本行FISH檢測(cè)，bcr/abl(+)細(xì)胞檢出率均為0%，提示FISH檢測(cè)bcr/abl轉(zhuǎn)陰的病人需靠靈敏度更高的RTPCR監(jiān)測(cè)，一旦RTPCR結(jié)果呈陽(yáng)性，即需配合FISH監(jiān)測(cè)，以便及早發(fā)現(xiàn)病情變化，實(shí)施干預(yù)措施。

　　我們的研究還發(fā)現(xiàn)，非清髓性異基因干細(xì)胞移植后病人體內(nèi)Ph(+)細(xì)胞殘留時(shí)間較長(zhǎng)，但這并不意味著移植失敗。大多數(shù)病人隨者時(shí)間延長(zhǎng)及輔以供體淋巴細(xì)胞輸注(DLI)，Ph(+)細(xì)胞會(huì)逐漸減少并終消失。其原因可能是嵌合的供者T淋巴細(xì)胞通過(guò)識(shí)別宿主殘留細(xì)胞的次要組織相容性抗原(mMHC)或殘留的抗原呈遞細(xì)胞(DC)提呈遞的白血病相關(guān)抗原，活化并產(chǎn)生移植物抗白血病反應(yīng)(graft versus leukemia,GVL)，從而清除宿主體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞或遺傳學(xué)異常的造血干細(xì)胞。T 細(xì)胞、NK細(xì)胞協(xié)同參與了GVL效應(yīng)，CD4+ T細(xì)胞在GVL效應(yīng)中起主要作用，CD8+ Tc2亞群細(xì)胞可介導(dǎo)GVL效應(yīng)并在降低移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生率的同時(shí)防止移植物被排斥。這與非清髓性預(yù)處理干細(xì)胞移植后實(shí)施供者淋巴細(xì)胞輸注后產(chǎn)生的效應(yīng)一致[8-10]。

　　移植后病人體內(nèi)殘留的Ph(+)細(xì)胞比率下降不明顯、停滯甚至有增高趨勢(shì)時(shí)，應(yīng)實(shí)施臨床干預(yù)。病例6移植后8個(gè)月仍殘留70%的Ph(+)細(xì)胞，多次給予DLI, Ph(+)細(xì)胞比率反復(fù)升降，效果不好，后又輔以干擾素治療，效果仍然不好。目前病人仍處于血液學(xué)緩解期，正在考慮二次移植。

　　另外，移植成功也并不意味著病人就一定能夠長(zhǎng)期生存。病例2移植后Ph(+)細(xì)胞漸降，并于移植后15個(gè)月CC檢測(cè)Ph轉(zhuǎn)陰，但病人一般狀況卻一直不是很好，有嚴(yán)重的慢性移植物抗宿主病(cGVHD)表現(xiàn),終于移植后22個(gè)月因骨轉(zhuǎn)移而死亡。由于病人一直處于血液學(xué)緩解期，骨髓檢查并無(wú)復(fù)發(fā)傾向，所以我們考慮其骨轉(zhuǎn)移可能早在移植前就已發(fā)生，提示移植要把握好時(shí)機(jī)，及早進(jìn)行。病例5為一老年患者，年齡56歲，移植前已進(jìn)入加速期，但移植非常成功，移植后5個(gè)月Ph(+)細(xì)胞就降至20%，術(shù)后發(fā)生cGVHD，于術(shù)后1年死于間質(zhì)性肺炎。因此，如何防治cGVHD成為移植成功的關(guān)鍵之一。

　　綜上所述，CC、RTPCR和FISH 3種方法在檢測(cè)CML病人對(duì)治療的反應(yīng)時(shí)各有其特點(diǎn)：①CC可作為監(jiān)測(cè)CML患者治療過(guò)程中腫瘤負(fù)荷水平的基本手段;②在移植后早期細(xì)胞數(shù)少時(shí)，CC檢測(cè)結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確判斷體內(nèi)腫瘤負(fù)荷動(dòng)態(tài)變化時(shí)，以及治療病人體內(nèi)腫瘤負(fù)荷降低到CC不能檢出而RTPCR仍為陽(yáng)性時(shí)，需借助FISH來(lái)準(zhǔn)確檢測(cè)體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，監(jiān)測(cè)其動(dòng)態(tài)變化;③FISH檢測(cè)bcr/abl轉(zhuǎn)陰的病人需靠靈敏度更高的RTPCR監(jiān)測(cè)。根據(jù)病人所處的時(shí)期及體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷量選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，可以在不增加病人?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的前提下，對(duì)病人體內(nèi)腫瘤負(fù)荷實(shí)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為實(shí)施臨床干預(yù)提供可靠的依據(jù)。