納米抗體結構剖析 l 對缺失輕鏈的適應

1. 前 言  

與常規(guī)抗體VH相比較，在FR2區(qū)域，VHH有四個氨基酸突變，這是納米抗體的特征。在常規(guī)抗體中，這四個氨基酸殘基參與了與VL的相互作用，同時與常規(guī)抗體中所見的疏水相互作用位點相比，這些位點取代導致了VHH更高的親水性。這一變化展現了VHH對其缺失輕鏈的適應。研究表明，該突變不僅對 VHH 的溶解度很重要，而且可能是 VHH 穩(wěn)定性的關鍵決定因素。

2.1、VH與VHH之間的不同

VHH與VH相比較，顯著的特征就是VH中的疏水殘基被親水殘基所取代，這些被取代的殘基原本參與了VH與VL的相互作用。VHH中親水殘基取代的區(qū)域我們定義為“前”VH-VL作用界面。VHH為了適應缺失輕鏈，得益于這些疏水殘基被親水殘基所取代。

此外，VHH還有其他機制來適應其單域結構狀態(tài)。首先，VHH通常具有更長的CDR3。VHH第三個結合環(huán)擴大彌補了因缺失輕鏈造成的影響。通常情況下， VH中的三個CDR形成抗原結合區(qū)域，而VHH中更長的CDR3不僅可以增大抗體和抗原接觸面，還可以使得其結合基序多樣性更高。VHH中更長的CDR3還可以深入到酶的活性中心裂隙，從而更好地抑制或者調節(jié)酶的活性，而這是傳統抗體難以做到的，傳統抗體通常在 VH 和 VL 之間的結合間隙中結合抗原。

2.2、VHH結構域中的“前”VH-VL作用界面

在傳統抗體中，VH-VL之間的相互作用僅限于一些氨基酸殘基。一般來講，在VH有10個殘基與VL相互作用，分別是S/H35，V37，Q39，L45，W47，F/Y91，A/L93，X95，F/Y100和W103 (X95為不保守的CDR3殘基；F/Y100和W103均為CDR3殘基)。S/H35，V37，A/L93和 X95與VL作用弱甚至無作用。Q39, L45, W47, F/Y91, F/Y100以及W103同VL作用緊密。大多數芳香族氨基酸殘基形成疏水面，與VL發(fā)生疏水相互作用。

傳統抗體的FR2中V37、G44、L45和W47這4個氨基酸殘基是疏水性殘基，在進化中是相當保守的。而VHH中，它們突變?yōu)橛H水性的氨基酸殘基F37、E44、R45、G47，增加了VHH的溶解性，這一特征被認為是VHH的獨特標志。而這些取代也發(fā)生在VH與VL相互作用的位置。VHH與VH相比較，其他一些原本VH與VL反生相互作用的位置也發(fā)生了氨基酸的取代。表1顯示了在VHs中與VL相互作用的殘基，以及它們在700個VHHs中的分布情況，其中11位氨基酸殘基也被統計的原因是在VH中該氨基酸殘基與CH1發(fā)生相互作用，而VHH中缺失CH1。43和46位氨基酸殘基因為存在于VH-VL接口處，沒有直接與VL相互作用而同樣被列入表1中。VHH中值得注意的還是四個氨基酸的取代，當然也有一些其他氨基酸，雖然沒有四個氨基酸的取代那樣保守，但是他們的替代同樣也值得關注。而這些取代均主要是芳香族疏水性氨基酸殘基被親水性氨基酸殘基所取代。

第11位的保守異亮氨酸(Leu)是VH和 CH1之間的球窩連接的一部分。在駱駝VHH中，由于缺失CH1，第11位異亮氨酸(Leu)極可能會由于疏水性質而發(fā)生突變，而這一突變確實在單峰駱駝(Dromedary)中被觀察到(L11S)，這就說明第11位氨基酸殘基被替換為更小更親水的氨基酸殘基，有助于VHH的溶解性增加。不過在大羊駝(Llama)中，雖然同樣缺失CH1，但是這一替換是不保守的，在我們的數據庫中有84%的VHH第11為氨基酸為異亮氨酸(Leu)。這說明在大羊駝(Llama)中L11發(fā)生突變可能會對VHH結構產生影響，而單峰駱駝(Dromedary)可能克服這一問題。因此， L11在大羊駝(Llama)VHHs中的重要性是值得進行深入研究的。

第35位氨基酸殘基，雖然與 VL的接觸不是很緊密，但是也位于 VH-VL接口中。 研究表明，第35位氨基酸殘基主要由絲氨酸Ser(人VH 中占40%)或組氨酸His(人VH 中占21%)占據，并且在 97% 的情況下，定位于抗原結合位點。在VHH中，該位點主要由丙氨酸Ala和甘氨酸Gly占據，表明該位點在VHH中的作用不同。在第27位和第29位引入兩個體細胞突變熱點可以將CDR1從VHs中的31-35位殘基擴大到VHHs中的27-35位殘基。這種CDR1向N末端的延伸可能導致第35位氨基酸殘基在抗原結合中的作用不太突出。在VHH中第35位氨基酸殘基可能在CDR1定向和連接兩個β-折疊非常重要，G35的高頻率出現支持這一假設。

“鄰近區(qū)”由界面中的氨基酸殘基定義，這些氨基酸殘基接近抗原結合。第 35位和第95位氨基酸殘基通常被認為是常規(guī)抗體中“鄰近區(qū)”中重要的氨基酸殘基。這些氨基酸殘基通常與抗原結合有關，因此像D95這樣的親水性較低的殘基豐度很高。Gly，Tyr和Ser殘基也經常出現在第95位，這些殘基可能是VH和VL之間形成疏水裂隙的原因。在美洲駝VHH中，第95位氨基酸殘基也是高度可變的，但卻是由帶電的親水性氨基酸殘基占主導地位。這再次表明，雖然不那么明顯，但這也是對于VHH對缺失VL作出的適應。

同樣，通常在VH和VHH中第93位氨基酸為丙氨酸Ala。然而，在VHH中，該位置也有24%的氨基酸為天冬酰胺Asn。雖然該位點的突變不如其他位點那么明顯，但這也使得VHH更加親水。

第47位和第103位兩個色氨酸Trp殘基在 VH 和 VL 之間的作用中非常重要。如表1所示，W47在所有VHH 中均被取代，并被認為是駱駝重鏈抗體的標志。而W103在VHH中高度保守，所占比例高達95.8%。 這表明兩個色氨酸Trp殘基的功能完全不同。W47突變對增加VHH溶解性很重要，W103在VHH扮演著結構性的作用，可能對VHH正確折疊和內核穩(wěn)定有關系。

在VH改造為VHH過程中，發(fā)現V37F突變對人VH熱穩(wěn)定有影響。Davies和Riechmann還認為對人VH的FR2突變，會影響穩(wěn)定性和表達量。在一系列獨立的實驗中，獲得的結果表明，FR2的突變(位于“前”VH-VL作用界面)對穩(wěn)定性和表達量有影響。

2.3、突變增加VHH穩(wěn)定性 在生理條件下（PBS buffer）進行噬菌體文庫篩選，選擇識別Malasezzia furfar（Malf1）細胞表面蛋白的VHHs。然而，這些VHHs的應用需要在高濃度的洗發(fā)水中發(fā)揮作用。所獲得VHHs被證明在低濃度的洗發(fā)水中不能與Malf1結合。然而在有洗發(fā)水buffer的情況下進行篩選，獲得的VHHs能夠在洗發(fā)水中與Malf1結合，表明這些VHHs的穩(wěn)定性大大增加。對這些VHHs的序列分析發(fā)現，“前”VH-VL作用界面的殘基含有一些在VHHs中不經常出現的突變。

 氨基酸殘基Q/E44是被認為是VHHs的標志的四個殘基之一，與大多數VHs中的G44相比，屬于結構性取代。在選擇識別Malasezzia furfar（Malf1）細胞表面蛋白的VHHs時，發(fā)現幾個結合良好的VHHs存在R44突變。突變Q44R導致VHHs在洗發(fā)水中的穩(wěn)定性增加，而R44Q則顯著降低VHHs在洗發(fā)水中的穩(wěn)定性。此外，R44K并不影響在VHHs在洗發(fā)水中的結合，但是當pH值為11時，VHHs在洗發(fā)水中的結合能力減弱，因為K44的質子化程度較低。這表明，帶正電荷的R44對VHHs在洗發(fā)水中的穩(wěn)定性具有促進作用，電荷在VHH的這個區(qū)域很重要。

2.4、溶解度與穩(wěn)定性

VHH1被證明能夠在體外和體內抑制輪狀病毒，為了提高中和輪狀病毒的VHH的蛋白質溶解穩(wěn)定性，進行了突變篩選，。突變體R27A顯示出對胰蛋白酶的穩(wěn)定性增加，熱穩(wěn)定性增加，產量水平增加，親和力保持不變。  

另外兩個突變體是在“前”VH-VL作用界面上產生的。第一個突變體R45A未表現出明顯變化，其對胰蛋白酶敏感性不受影響，親和力不受影響，表達水平略有下降，熱穩(wěn)定性略有下降。這表明盡管R45的保存率很高，達到97%，但某些突變可能對VHH穩(wěn)定性不會產生明顯的影響。

氨基酸K43位置的突變，也是高度保守的，占86%，確實對穩(wěn)定性產生了巨大的影響。雖然T43存在于所有VHHs中的4%，但由于細胞內的積累，K43T導致生產水平非常低。產生這種突變體的酵母細胞的細胞內部分在考馬斯亮藍染色的凝膠上確實顯示出VHH的積累，然而，這種部分不能被純化，可能是由于聚集。這表明分泌受到嚴重阻礙，這可能是由不適當的折疊造成的。  

與野生型H14相比，突變體H14M（K43T和E44R）的mRNA表達量下降了三倍，與野生型R2的mRNA水平相比，突變體R2M（K43T和E44R）下降了兩倍多。作為對照實驗，測定了針對Malf1的VHHs的mRNA水平。四個VHHs，兩個含有T43R44（D12和A7M），兩個含有T43Q44（D12M和A7），顯示的mRNA數量大致相等。這表明所做的突變沒有引起mRNA的急劇不穩(wěn)定。

D12、A7和2個突變體的Northern印跡。左上角是RNA凝膠電泳圖；在右上方的角落是相應的Northern印跡；底部是體積計算和相對密度。

盡管H14M和R2M的mRNA不穩(wěn)定，但少量的突變體VHH蛋白可以被純化，并在洗發(fā)水中測試其穩(wěn)定性。但這些突變并沒有導致VHH-R2和VHH-H14在洗發(fā)水中的結合力增加。，雖然這些殘基已被證明對洗發(fā)水中的穩(wěn)定性很重要，但它們并不是這種穩(wěn)定性的決定因素。

由于密碼子的使用被證明對mRNA的穩(wěn)定性有影響，可能是密碼子的使用對這些突變體不是好的。malf-D12使用的密碼子是ACC（T），CGG（R），而H14M和R2M使用的密碼子是ACG（T）和CGG（R）。因此，R44的密碼子的使用不可能完全導致mRNA的不穩(wěn)定，盡管這個密碼子是在釀酒酵母中不常用的Arg密碼子（1.7/1000）。在釀酒酵母中，Thr的密碼子使用量為ACT（20.2）、ACA（17.7）、ACC（12.6）和ACG（8.0）。H14M和R2M的密碼子使用情況與malf-D12的密碼子使用情況相比，在釀酒酵母中的生產情況不那么理想。這可能是對mRNA穩(wěn)定性下降的一個解釋。然而，mRNA的穩(wěn)定性很復雜，這可能不是不穩(wěn)定的原因。   為增加蛋白水解穩(wěn)定性而構建的抗輪狀病毒VHH1的突變體K43T，也顯示出蛋白生產水平的急劇下降。為了排除在H14和R2的突變體中看到的mRNA穩(wěn)定性的下降導致產量下降，我們測定了mRNA的表達水平。圖3顯示了為降低胰蛋白酶敏感性的突變篩選而產生的八個突變體的Northern印跡。   圖3顯示突變體K43T的mRNA沒有明顯下降。這表明分泌受阻是由于蛋白質水平的問題，并進一步支持這一突變導致折疊問題的假設。

3. 小 結  

VH-VL界面相互作用的殘基是高度保守的。這些殘基通常是VH中大的、疏水的和芳香族的殘基，具有與VL相互作用和形成結合裂隙的特殊功能。如果沒有任何進一步的實驗論證，人們可能很輕易地認為，在缺乏VL的VHHs中，這些殘基的重要性較低，保守性也較低。然而VHHs中的這些殘基具有更高的可變性，這些殘基的重要性表現在通過將疏水殘基替換成更親水和常帶電荷的殘基。

疏水殘基到親水殘基取代的一個特殊例外是W103。這個大芳香族分子和非常疏水性的殘基在96%的VHHs中也可以看到。這意味著W103在VHHs中的作用與 "前 "VH-VL界面中的其他殘基不同。

從VH到VHH觀察到的替換明顯增加了親水性。在這里，我們?yōu)?nbsp;"前 "VH-VL界面中的殘基的更廣泛的功能提供了證據這些殘基，特別是親水的KEREF/L延伸部分的殘基是決定VHHs穩(wěn)定性的關鍵因素。對殘基分布的研究顯示，該區(qū)域的替代率高。此外，第43、44和（在較小程度上）第45位的突變對穩(wěn)定性有極大的影響。這表明，這些殘基在VHHs的穩(wěn)定性中具有關鍵作用。