研究證明了土著細菌具有鐵依賴性機制,可以抑制宿主鐵的運輸和儲存。通過微生物代謝物的高通量篩選,研究人員發(fā)現(xiàn),腸道菌群產(chǎn)生的代謝物能抑制腸道鐵吸收主要轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子 2α (HIF-2α),并增加鐵存儲蛋白鐵蛋白 (Ferritin),從而抑制宿主的鐵吸收。兩種菌群代謝物—— DAP 和 Reuterin,通過抑制異二聚化作用作為 HIF-2α 抑制劑,可以有效緩解全身鐵超負荷。研究提供了腸道菌群代謝串擾的證據(jù),且其對于系統(tǒng)性鐵穩(wěn)態(tài)是必不可少的。
腸道菌群通過抑制 HIF-2α 的表達限制鐵的吸收
評估 C57BL/6J 無菌 (GF) 小鼠不同飲食鐵限制的血液學反應(yīng),結(jié)果表明本地腸道微生物種群與寄主之間存在著對鐵的競爭,在鐵限制條件下更為明顯。GF 小鼠和無特定病原體動物 (SPF) 小鼠都發(fā)生了鐵依賴性肝臟鐵調(diào)素 (Hepcidin) 表達下調(diào)。用廣譜抗抗生素 Cocktail (Abx) 處理的 SPF 小鼠中,鐵調(diào)素的表達與對照組沒有差異,因此,頂端轉(zhuǎn)運蛋白 Dmt1 和 Dcytb 的 mRNA 水平是由 SPF 小鼠的飲食鐵缺乏引起的,此外,Dmt1 和 Dcytb 表達水平在缺鐵 GF 小鼠中劇增。在基礎(chǔ)鐵供應(yīng)條件下,GF 小鼠中 Dmt1 和 Dcytb 的表達水平也高于對應(yīng)的 SPF 組。利用相同飲食 SPF 小鼠糞便懸濁液灌胃 GF 小鼠進行常規(guī)化 (GF-conv) 發(fā)現(xiàn),GF-conv 小鼠的 CBC 值低于 GF 組 (缺鐵癥狀),Dmt1 和 Dcytb mRNA 水平也降低。Abx 處理也進一步證實腸道菌群在 Dmt1 和 Dcytb 表達中的作用。一致的是,在鐵缺乏反應(yīng)中,GF 小鼠沒有表現(xiàn)出 HIF-2α 依賴性促炎介質(zhì)上調(diào)。用 abx 處理上皮細胞 Hif-2α 缺失的小鼠(Hif-2αΔIE mice),Dmt1 和 Dcytb mRNA 表達水平不變,Hif-2α 不缺失的小鼠則上調(diào)。免疫組化分析,GF 十二指腸上皮細胞 HIF-2a 過表達與內(nèi)在 VHL 缺失結(jié)果一致??傊c道菌群可抑制小腸中基礎(chǔ) HIF-2α 的表達和活性。
微生物代謝產(chǎn)物抑制 HIF-2α 的表達和功能
利用人多瘤干細胞 (hPSCs) 產(chǎn)生人的腸道類器官 (HIOs),將活性與滅活的非致病性共生大腸菌菌株分別顯微注射到 HIO 內(nèi)腔中,只有活性菌株組才能誘導(dǎo) HIF-2α 及 DMT1 和 DCYTB 的表達,表明腸道 HIF-2α 抑制的機制與氧氣水平無關(guān)。
十二指腸和糞便有機提取物抑制了細胞中被誘導(dǎo)的 HIF-2α 表達,糞便提取物對 DFO (缺鐵誘導(dǎo)物) 誘導(dǎo)的 HIF-1α 表達沒有影響,證實了腸腔提取物對 HIF-2α 有特殊作用。GF-conv 小鼠的腸道提取物下調(diào)了 DFO 介導(dǎo)的 HIF-2α 誘導(dǎo),而 GF 小鼠腸道提取物不能,證明了 HIF-2α 抑制性化合物源于微生物。 經(jīng)篩選,建立腸道菌代謝物庫并且從中鑒定出三種代謝物: Butyrate , Propionate 和 DAP,并在細胞中驗證了這三種化合物在蛋白質(zhì)水平上抑制 HIF-2α 表達。通過三種化合物在腸道的代謝水平以及對 HIF-2α 的抑制水平分析,綜合表明,內(nèi)源性細菌衍生的代謝產(chǎn)物高特異性地抑制 HIF-2α。
微生物代謝物對 FTN 的表達至關(guān)重要
已知,破壞腸道鐵存儲蛋白 FTN 增加鐵吸收能力。在基礎(chǔ)鐵條件下,GF 十二指腸中 FTN 的表達明顯低于 SPF 十二指腸,在 35ppm 鐵飲食中,肝臟和脾臟中更為明顯。在抗生素處理的小鼠中,十二指腸、肝臟和脾臟中的 FTN 表達顯著降低。GF-conv 小鼠的十二指腸 FTN 表達迅速恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。Ftn mRNA 在十二指腸中的表達沒有變化,排除了腸道菌群的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
在腸特異性 Hif-2αΔIE 小鼠中,Abx 降低十二指腸 FTN 蛋白的表達,表明腸道微生物群調(diào)控 FTN 不依賴于 HIF-2a。經(jīng)過 Abx 處理后,缺乏 NCOA4 (Ncoa4 -/-) 十二指腸的 FTN 下調(diào)水平與野生型對照相似,Abx 下調(diào) Tlr2,4-/- 和 Myd88-/- 小鼠的 FTN 表達水平,由此排除了主要的細菌感應(yīng)途徑。且代謝物 Butyrate , Propionate 和 DAP 對 FTN 調(diào)節(jié)沒有影響。
DAP 通過阻斷 HIF-2α 異二聚化抑制其活性
在體內(nèi),DAP 抑制缺鐵和抗生素誘導(dǎo)的 HIF-2α 活性, Butyrate 和 Propionate 則不能。GF, GF-conv 和 SPF 小鼠糞便代謝物不影響細胞 Hif-2α mRNA 水平。 Butyrate 和 Propionate 上調(diào)了細胞 Hif-2α mRNA 水平,而 DAP 處理則沒有作用,表明腸道菌群介導(dǎo)的 HIF-2α 抑制作用與 mRNA 的水平無關(guān)。HIF-2α 5'UTR 帶有鐵反應(yīng)元件 (IRE),使其翻譯容易受到鐵調(diào)節(jié)蛋白 (IRP) 介導(dǎo)的抑制。 Butyrate 、 Propionate 或 DAP 上調(diào)了 HIF-2α-IRE 的活性,排除了其通過 IRE 機制作用。PT2385 是 HIF-2α 的抑制劑,通過與 PAS-B 結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合干擾 HIF-2α-ARNT 異二聚體的形成。DAP 同樣地抑制了 HIF-2α-ARNT 相互作用,但是沒有 PT2385 抑制程度高。數(shù)據(jù)表明,細菌代謝產(chǎn)物能充當抑制 HIF-2α 活性的內(nèi)源性配體。
圖 4. DAP 通過阻斷異二聚體抑制 HIF-2α 的體內(nèi)活性
限制鐵水平導(dǎo)致微生物代謝產(chǎn)物更有效地抑制 HIF-2α
通過糞便代謝物處理細胞發(fā)現(xiàn),鐵的缺乏選擇性地促進了微生物生長或代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,這些代謝物具有較高水平的 HIF-2α 抑制作用,但缺鐵小鼠的 DAP 濃度沒有變化。鐵缺乏反而降低了腸道 Butyrate 的濃度,并且沒有改變乙酸鹽和 Propionate 的水平。16S rRNA 擴增子測序分析結(jié)果表明,在十二指腸提取物和糞便中,乳桿菌是一種由于鐵限制而相對豐度顯著增加的菌屬??傊拗畦F水平可能有利于特定細菌種群的生長,產(chǎn)生腸道對抑制 HIF-2α 的代謝產(chǎn)物。
腸道 Reuterin 通過阻斷異源二聚化抑制 HIF-2α 活性
Reuterin 是由羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生,在 GF 腸道中未被檢測出,但在常規(guī)化后增加,Abx 的處理也降低了腸道中 Reuterin 的濃度。Reuterin 致使 HIF-2α 在人腸上皮細胞系中的表達和活性呈劑量依賴性下調(diào),與 DAP 相似 Reuterin 破壞了 HIF-2α-ARNT 相互作用,PT 結(jié)合位點的突變則發(fā)生完全逆轉(zhuǎn)。
益生菌或抗生素改善小鼠模型中鐵相關(guān)疾病
肝臟鐵調(diào)素基因敲除小鼠 (HAMPΔLiv mice) 中鐵發(fā)生過剩,用 DAP 處理導(dǎo)致胰腺和心臟的鐵顯著減少,但對肝臟不起作用。用 DAP 或羅伊氏乳桿菌處理 HAMPΔLiv 小鼠,能消除 HIF-2α 依賴性腸鐵轉(zhuǎn)運蛋白 (DMT1,Dcytb 和 FPN) 的劇增。在小腸中,通過 Abx 干預(yù) Reuterin 和 DAP 的水平,以抑制共生和/或抑制 HIF-2α 的代謝產(chǎn)物以改善貧血。綜上所述,基于微生物組的療法可用于治療鐵相關(guān)疾病。