發(fā)現(xiàn)新型重組酶，將大段DNA高效整合到人類基因組

生命科學(xué)的飛速發(fā)展，為科學(xué)家自由操縱基因提供了前所未有的簡便和高效。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室里，你可以很方便地通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR） 將一個(gè)基因克隆下來，并連接到相應(yīng)的表達(dá)載體 （質(zhì)粒） 上。 遺憾的是，上述的分子克隆實(shí)驗(yàn)通常是在原核生物中進(jìn)行的 （例如細(xì)菌） ，但涉及真核生物基因組的操作，特別是幾千個(gè)核苷酸長度的DNA序列的整合，仍然十分具有挑戰(zhàn)性。這也限制了合成生物學(xué)、細(xì)胞工程和基因治療等新興領(lǐng)域的發(fā)展。該研究開發(fā)了一種算法來識別數(shù)千種全新的大絲氨酸重組酶 （LSR） 及其DNA附著位點(diǎn)，將已知LSR的多樣性擴(kuò)大了1倍。 這些LSR可以將超過7kb的大型DNA片段、高效地插入人類基因組，為基因組工程化研究以及人類遺傳病治療提供了新的“百寶箱”！ 

人類遺傳病的治療一直是亟待解決的難題。隨著人類基因組學(xué)的發(fā)展，越來越多人類遺傳病基因被相繼發(fā)現(xiàn)，通過改變遺傳病患者的基因序列，從根本上人類遺傳病也由此成為了一種很有前景的治療方法。 導(dǎo)致遺傳病的原因有很多，有時(shí)候只是編碼蛋白的基因上的一個(gè)堿基出錯(cuò)了，但有時(shí)候可能是一大段基因出現(xiàn)了缺失、重復(fù)或重排，這種情況只能通過基因整合的方法將其修復(fù)。目前主要依靠DNA雙鏈斷裂 （DSB） 來實(shí)現(xiàn)基因整合，例如同源重組 （HR） ，但這種基因編輯手段并不可靠，有時(shí)候會(huì)導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂部位附近的堿基缺失，或者產(chǎn)生隨機(jī)DNA片段插入。 因此，該研究的通訊作者 Patrick Hsu 博士及其團(tuán)隊(duì)希望開發(fā)一種能夠?qū)⒋笃蜠NA整合到人類基因組中的分子工具，且不需要產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，也不需要依靠細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制。

大絲氨酸重組酶（LSR）是噬菌體攜帶的一種整合酶，它們通過識別細(xì)菌基因組和噬菌體DNA片段上的特定序列，將大片段DNA序列整合到細(xì)菌的基因組中。這種機(jī)制使位點(diǎn)特異性大片段DNA插入成為可能，而不需要任何細(xì)胞輔助因子，也不會(huì)產(chǎn)生有害的DNA雙鏈斷裂 （DSB） 。 在這項(xiàng)新研究中，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種算法來檢索不同種類的噬菌體中可能存在的LSR序列，經(jīng)過粗略篩選后，他們發(fā)現(xiàn)了6207種具有序列特異性的LSRs。這將已知的LSRs數(shù)目擴(kuò)展超過100倍。 

新型LSR的系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和分類 緊接著，研究團(tuán)隊(duì)合成并測試了超過60種不同的新發(fā)現(xiàn)LSR，其中高效的新型LSR大大優(yōu)于其他重組酶。例如，與此前常用的Bxb1相比， 新型LSR的質(zhì)粒重組效率要高7倍，基因組插入效率為40-75%，插入的DNA片段大小超過7kb。 

新型LSR具有很高的插入重組效率 基于這些關(guān)鍵特性，研究團(tuán)隊(duì)將收集到的新型LSR分類為著陸墊型、基因組靶向型或多靶向型，并指向三種不同的應(yīng)用： 1）在基因組著陸區(qū) （landing pad） 上安裝擴(kuò)增文庫的新方法；2）大片段DNA的基因組整合和同一細(xì)胞內(nèi)多個(gè)區(qū)域的同時(shí)整合；3）直接靶向人類基因組的特定位點(diǎn)。

著陸墊型LSR 不僅如此，研究團(tuán)隊(duì)還展示了新型LSR可以在無病毒載體遞送的情況下，直接整合質(zhì)?；驍U(kuò)增子文庫到基因組上，顯示了它們在改進(jìn)功能基因組學(xué)應(yīng)用研究中的強(qiáng)大潛力。此外，研究團(tuán)隊(duì)還指出， 這些LSRs可以用于CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)，與目前使用慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因遞送相比，LSRs可以將目標(biāo)基因整合到特定位點(diǎn)，極大地避免了慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因遞送的隨機(jī)性。

特異性人類基因組靶向重組酶的發(fā)現(xiàn) 總而言之，這項(xiàng)研究通過算法檢索到數(shù)千種新型LSR，并對其中60多種LSR進(jìn)行了功能驗(yàn)證。表明這些新型LSR具有更高的重組效率，且大可以插入超過7kb的DNA大片段，為基因編輯的工具箱又增添了一種新工具，為人類遺傳病治療開辟了新道路。