分離外泌體的方法

分離外泌體的方法

細胞碎片、凋亡體、外泌體和其他EV一起存在于生物體液中，具有密度、形狀、大小和表面蛋白等物理性質(zhì)的外泌體是分離機制的基礎(chǔ)。結(jié)合兩種或多種分離方法有助于有效地將外泌體與其他干擾成分分離。

超速離心

離心是一種利用不同的離心力根據(jù)顆粒成分的密度、大小和形狀沉淀顆粒成分的過程。超速離心是一種離心過程，多使用6×106 g離心力，有助于隔離更小的組件，例如，核糖體、蛋白質(zhì)、病毒、外泌體和其他EV。加速度（g）、旋轉(zhuǎn)半徑、樣品粘度和沉降路徑長度是有效分離外泌體的決定因素。20至250nm之間的粒徑分數(shù)可以通過超速離心分離，隨后的離心或尺寸排阻過程產(chǎn)生所需的外泌體。超速離心法被認為是外泌體分離的金標準方法，外泌體需要1×105至2×105 g離心1小時。在順序離心過程中，MVs、凋亡小體、細胞碎片、細胞和其他具有較高浮力密度的顆粒在外泌體之前沉淀。然而，必須注意的是，由于密度和大小重疊，大多數(shù)當前方法只能富集小EV（即外泌體）。

從生物體液中提取外泌體，從細胞中分離外泌體的超速離心方法

密度梯度超速離心

有助于根據(jù)尺寸、結(jié)構(gòu)和形態(tài)差異分離和分析納米級材料。DGUC“細化”分離的囊泡，并使用密度為1.07 g/mL或更低的密度梯度培養(yǎng)基。水中碘沙醇、冰冷的PBS和蔗糖是用于外泌體分離的常見梯度培養(yǎng)基。有市售的碘沙醇密度梯度分餾膜，用于將外泌體與非囊泡成分分離。將生物懸浮液添加到梯度培養(yǎng)基中，并以完整的梯度分層組分。DGUC有助于分離具有相同梯度的樣品。凋亡小體、蛋白質(zhì)聚集體和其他非外泌體微囊泡可能通過超速離心干擾分離的外泌體產(chǎn)物。DGUC有助于克服超速離心的局限性，并提供純凈的外泌體。DGUC在精細化和高性能外泌體分離方法中的應(yīng)用。簡而言之，在分離細胞碎片后，應(yīng)用1×105 g用60%碘沙醇離心3小時，然后用1×10離心5 用40%碘沙醇g18小時有助于形成多達12個碘沙醇梯度級分和兩個外泌體級分。超速離心使用連續(xù)的密度梯度或逐步梯度來小化這些顆粒材料對外泌體的干擾。

過濾

過濾方法僅取決于分子量或組分的大小，并有助于獲得佳的外泌體產(chǎn)量。超濾、凝膠過濾和靜水透析包含在外泌體分離的過濾原理下。外泌體可以根據(jù)其定義的分子量或體積排阻限，使用標準膜過濾器從其他EV組分和細胞碎片中分離出來。市售的聚偏二乙烯碳酸酯膜過濾器具有各種孔徑范圍，用于滲透、納濾和微濾應(yīng)用。

超濾

它使用孔徑為50-450 nm的膜過濾器從細胞碎片和較大的EV中分離外泌體。通過使用納米尺寸的濾膜，可以分離出目標尺寸的外泌體。超濾法通常用作超速離心的后續(xù)步驟，以及凝膠過濾和色譜的一步。超濾可以通過切向流過濾（TFF）或直流過濾（DFF）方法進行處理。DFF方法也稱為死端過濾，存在膜污染和顆粒分離受損的問題。此外，DFF僅適用于小體積樣品，例如高達30 mL的樣品。

TFF也稱為錯流過濾是一種更快速、高效和方便的分離大規(guī)模外泌體體積的過程，TFF是樣品流體切向流過濾膜并避免形成濾餅或堵塞的過程。簡而言之，樣品通過0.2μm聚醚砜（PES）膜過濾，較大的顆粒物質(zhì)（如細胞碎片和凋亡體）被滯留出來。然后，包括外泌體在內(nèi)的半處理濾液樣品通過TFF系統(tǒng)通過500 kDa截止濾芯進行超濾過程，進料流速為120 mL/min，跨膜壓力<3.5 psi跨膜壓力>10:1，外泌體太大而無法通過毛孔并保持保留。相反，包括游離蛋白在內(nèi)的小分子通過中空纖維孔并作為滲透物洗脫并從過程中丟棄。為了獲得高質(zhì)量的外泌體分離和純化，通過TFF連續(xù)重新濃縮截留物樣品，并去除小于500 kDa的污染物。將純化的外泌體重懸并儲存在-80°C的聚對苯二甲酸乙二醇（PETG）瓶中的0.1M蔗糖中，并用于所需的分析。通常，通過結(jié)合超濾加超速離心或離心加超濾等不同分離方法可以成功分離外泌體，使用較低孔徑的膜過濾和超速離心可提供純外泌體。

靜水過濾透析

它主要有助于將整個EV從高度稀釋的溶液中分離出來，而無需超速離心過程。280Musante等人展示了用于從尿液樣本中分離EV的HFD方案。在HFD的初始步驟中，用2000×g離心樣品以去除細胞，細菌和碎片作為沉淀。然后，將上清液保存在透析膜（1000kPa）中，1000kPa或更小的顆粒相應(yīng)地以靜水壓差通過膜。通過離心將外泌體囊泡沉降40,000×g。在HFD分離過程中，外泌體級分在早期階段恢復(fù)，與多步離心相比，這被認為是一個優(yōu)勢。與超速離心相比，HFD也被認為是一種有效的方法。

體積排阻色譜（SEC）

該方法主要有助于從分離的外泌體中去除蛋白質(zhì)和脂蛋白雜質(zhì)，它已被用于從尿液和血漿蛋白中分離外泌體。它被用作超速離心和超濾的后續(xù)分離方法。瓊脂糖2B/CL4B、qEV和瓊脂丙烯酸S-400是通常用于凝膠過濾色譜分離外泌體的色譜柱。SEC可以在低壓下進行，這有助于分離具有完整完整性的外泌體。

降水

它是一種基于生物體液中外泌體的電荷沉淀的方法。帶負電荷的外泌體可以與PEG 35,000 Da基質(zhì)中帶正電荷的魚精蛋白相互作用并形成沉淀。外泌體的回收和重懸比基于超速離心的分離更有效。聚合物沉淀法以更少的勞動力和昂貴的設(shè)備分離尿外泌體的潛在益處。該方法首先利用DL-二硫蘇糖醇溶液還原或去除Tamm-Horsfall蛋白的聚合網(wǎng)絡(luò)，然后在25°C和30 min下僅用10,000 × g的向心力即可實現(xiàn)外泌體的沉淀。還有利用聚合物沉淀方法并消除超速離心的商業(yè)試劑盒。ExoQuick?、Exo-spin?是來自Invitrogen?和miRCURY?的市售總外泌體分離試劑。

免疫親和相互作用

免疫親和法是利用外泌體表面蛋白（抗原）與其靶抗體或分離配體分子之間的免疫親和相互作用原理分離純外泌體的理想方法。它有助于根據(jù)其表面標志物分離特定類型的外泌體。基于微孔板的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是免疫親和分離試劑盒的一個例子，用于根據(jù)外泌體表面標志物分離外泌體。Tetraspanin蛋白是這種分離方法的決定因素?？笴D9、抗CD63和抗CD81是免疫親和外泌體分離中使用的抗體的常見示例。免疫親和法可用于從結(jié)腸癌細胞中分離外泌體，其效率高于超速離心和密度梯度分離。另外還有一種外泌體分離方法，該方法采用抗體包被的基于磁性顆粒的技術(shù)來分離外泌體。

微流控分離

基于微流體的外泌體分離可以包括用于外泌體捕獲的免疫親和方法，納米多孔膜篩分方法或微柱上的納米線用于外泌體捕獲。所有三個系統(tǒng)都需要具有粘彈性分析和電操作的芯片才能進行外泌體分離過程。外泌體的特異性很高，采用基于微流控芯片的免疫親和捕獲方法。尺寸范圍在40-100nm之間的外泌體被這種微流體芯片特異性地捕獲，在外泌體分離和定量方面的益處。篩分方法可用于通過壓力或通過電泳從全血中過濾外泌體，壓力的利用使分離時間更短，電場導(dǎo)致高外泌體純度。特異性、可重復(fù)性、低分離時間和更低的分離成本是基于微流體的外泌體分離的一些優(yōu)點。