遺傳藥物增強(qiáng)PD-1抑制劑抗腫瘤作用機(jī)制

腫瘤微環(huán)境中，持續(xù)抗原刺激引起T細(xì)胞耗竭，高表達(dá)多種抑制性受體、增殖受損、代謝異常，盡管PD-1阻斷療法表現(xiàn)出一定抑瘤效應(yīng)，但在多數(shù)實(shí)體瘤中療效欠佳。耗竭T細(xì)胞具有漸進(jìn)分化和異質(zhì)性的特征，耗竭前體T細(xì)胞可自我更新，有更強(qiáng)的重編程性，PD-1阻斷治療后擴(kuò)增，并分化為終末耗竭T細(xì)胞，喪失對(duì)PD-1抑制劑響應(yīng)性。

基于DNA去甲基化藥物地西他濱能夠增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷活性，該團(tuán)隊(duì)在復(fù)發(fā)難治性霍奇金淋巴瘤中開(kāi)展系列臨床試驗(yàn)，觀察到地西他濱與PD-1抑制劑聯(lián)合治療能夠提升腫瘤完全清除率，此創(chuàng)新療法已寫(xiě)入中國(guó)淋巴瘤診療指南。然而，表觀遺傳途徑干預(yù)增強(qiáng)PD-1抑制劑抗瘤療效的具體細(xì)胞學(xué)與分子調(diào)控機(jī)制依然不清楚。

該研究發(fā)現(xiàn)低劑量DNA去甲基化藥物地西他濱聯(lián)合PD-1抑制劑通過(guò)維持AP-1家族轉(zhuǎn)錄因子JunD表達(dá)與活性而促進(jìn)CD8+耗竭前體T細(xì)胞擴(kuò)增，從而獲得更強(qiáng)效且持久抗腫瘤活性。

為探討表觀遺傳藥物干預(yù)能否增強(qiáng)PD-1抑制劑的抗腫瘤效能，首先，研究團(tuán)隊(duì)將低劑量地西他濱預(yù)處理的OT-I小鼠來(lái)源CD8+ T細(xì)胞在體外與MC38-OVA腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，或?qū)細(xì)胞輸注同源的MC38-OVA荷瘤小鼠，均發(fā)現(xiàn)地西他濱與PD-1抑制劑聯(lián)合處理組，CD8+ T細(xì)胞對(duì)腫瘤的特異性殺傷活力增強(qiáng)。

隨后，為闡明地西他濱介導(dǎo)的增效作用是否通過(guò)對(duì)CD8+耗竭前體T細(xì)胞調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的，研究團(tuán)隊(duì)分別分選了地西他濱處理后的CD8+耗竭前體T細(xì)胞與終末耗竭T細(xì)胞，再給予PD-1抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，地西他濱修飾后的CD8+耗竭前體T細(xì)胞聯(lián)合PD-1抑制劑后擴(kuò)增能力與效應(yīng)功能明顯增強(qiáng)，而地西他濱并不能重塑終末耗竭T細(xì)胞使產(chǎn)生免疫治療響應(yīng)性。進(jìn)一步，在多種移植瘤小鼠模型中，研究團(tuán)隊(duì)觀察到地西他濱與PD-1抑制劑聯(lián)合治療抗瘤作用增強(qiáng)，并證實(shí)體內(nèi)亦通過(guò)激活腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+耗竭前體T細(xì)胞而獲得更強(qiáng)更持久的抑瘤作用。

為了進(jìn)一步探究DNA去甲基化藥物地西他濱干預(yù)增強(qiáng)PD-1抑制劑抗瘤作用分子機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)分選了各實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞，進(jìn)行染色質(zhì)可及性測(cè)序 (ATAC-seq) 、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）和匹配的單細(xì)胞T細(xì)胞受體測(cè)序（scTCR-seq）。多組學(xué)數(shù)據(jù)證實(shí)了地西他濱與PD-1抑制劑聯(lián)合治療增強(qiáng)CD8+耗竭前體T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，且TCR多樣性增加。聯(lián)合用藥組CD8+耗竭前體T細(xì)胞，染色質(zhì)開(kāi)放性和轉(zhuǎn)錄層面都表現(xiàn)出與T細(xì)胞效應(yīng)、記憶功能相關(guān)特征的上調(diào)，而與耗竭相關(guān)特征的下調(diào)。 值得注意的是，與PD-1抑制劑單一療法相比，聯(lián)合用藥組CD8+ T細(xì)胞中AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族成員JunD表達(dá)水平增加，而且AP-1家族的基序（motif）在聯(lián)合治療后新開(kāi)放的染色質(zhì)區(qū)域中高度富集。

通過(guò)結(jié)合公共數(shù)據(jù)、構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)PD-1抑制劑處理后，CD8+ T細(xì)胞中JunD及其靶基因含量降低，而聯(lián)合治療可以維持其表達(dá)水平。 接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)了AP-1/JunD信號(hào)通路在聯(lián)合治療提高抗瘤效應(yīng)中的重要作用。首先，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和回輸實(shí)驗(yàn)的單細(xì)胞數(shù)據(jù)一致顯示，JunD表達(dá)水平較高的細(xì)胞也表現(xiàn)出較高的T細(xì)胞激活特征。此外，當(dāng)CD8+ T細(xì)胞中JNK/AP-1信號(hào)通路活性被抑制時(shí)，聯(lián)合治療誘導(dǎo)的T細(xì)胞殺瘤效能降低；而使用JNK激活劑，同樣觀察到PD-1抑制劑增敏效應(yīng)。

研究團(tuán)隊(duì)采用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建JunD敲除的CD8+ T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖活力減低，且對(duì)聯(lián)合用藥的響應(yīng)性下降。由此證明，PD-1阻斷治療后JunD下調(diào)可損害T細(xì)胞的長(zhǎng)期抗瘤活性，而地西他濱聯(lián)合方案通過(guò)維持AP-1/JunD通路的活性而增強(qiáng)CD8+ 耗竭前體T細(xì)胞的擴(kuò)增與效應(yīng)功能，進(jìn)而產(chǎn)生高效、持久抗腫瘤免疫反應(yīng)性 ，提示對(duì)于臨床實(shí)踐中PD-1抑制劑單藥治療抵抗，尤其是治療后JunD表達(dá)降低的腫瘤患者，使用該聯(lián)合療法有望臨床獲益。