化療耐藥性前列腺癌干細(xì)胞的代謝指紋圖譜

化學(xué)耐藥性是癌癥治療中重要的挑戰(zhàn)之一。腫瘤內(nèi)癌癥干細(xì)胞的存在可能有助于化療耐藥性，因?yàn)檫@些細(xì)胞表達(dá)高水平的擠出泵和使治療藥物失活的異生代謝酶。盡管癌細(xì)胞代謝適應(yīng)取得了進(jìn)展，但對(duì)化療耐藥的癌癥干細(xì)胞的代謝適應(yīng)知之甚少。在這項(xiàng)研究中，我們通過(guò)液相色譜-高分辨率光譜法結(jié)合細(xì)胞毒性測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡、定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng) （qPCR） 和脂肪酸氧化在抗抗雄激素 2-氫氟氟酰胺的前列腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析具有癌癥干細(xì)胞特征，與其親本雄激素敏感細(xì)胞系相比。代謝指紋圖譜顯示ESI+的106種代謝物中有850種，ESI中的67種代謝物中有446種，敏感細(xì)胞系和耐藥細(xì)胞系之間存在顯著差異。使用明確鑒定的代謝物進(jìn)行的途徑分析揭示了參與能量代謝以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的途徑的變化。酶表達(dá)分析驗(yàn)證表明，化療耐藥前列腺癌干細(xì)胞代謝休眠，脂肪酸氧化、蛋氨酸代謝和ADP-核糖基化減少。我們的研究結(jié)果揭示了癌細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)的途徑，這可能有助于耐藥機(jī)制。

前列腺癌 （PCa） 是男性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，年發(fā)病率為 268500 例（占男性所有癌癥類(lèi)型的 27%）（Siegel 等人，2022 年）。根據(jù)西班牙腫瘤內(nèi)科學(xué)會(huì) （SEOM） 的數(shù)據(jù)，PCa 是 2020 年西班牙常見(jiàn)和普遍的惡性腫瘤（Cassinello 等人，2018 年;岡薩雷斯·德?tīng)柊柊偷热耍?021 年）。盡管有高度發(fā)達(dá)的治療方法，但以雄激素非依賴(lài)性生長(zhǎng)為特征的晚期疾病每年增加 4%-6%（Siegel 等人，2022 年）。一旦前列腺癌進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌 （CRPC），治療基于雄激素受體抑制和/或抗有絲分裂紫杉烷化療，以提高患者的生存率（Menges 等人，2022 年）。然而，盡管這種治療前列腺癌的益處，比預(yù)期的要多，但對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性，然后，化療的效果受到阻礙，治療選擇有限（Lohiya等人，2016）。目前，化學(xué)耐藥性的發(fā)展是癌癥治療中大的挑戰(zhàn)之一。對(duì)治療的耐藥性可能是由癌癥干細(xì)胞（CSCs）的存在引起的，CSCs是腫瘤內(nèi)具有長(zhǎng)期復(fù)制潛力，自我更新和多能能力的細(xì)胞亞群。

已經(jīng)描述，前列腺癌干細(xì)胞對(duì)大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)療法具有抗藥性，并且構(gòu)成了癌細(xì)胞克隆擴(kuò)增的來(lái)源，這被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的原因（Leao等人，2017;斯克沃爾佐夫等人，2018 年）。CSC通過(guò)重新激活誘導(dǎo)周?chē)?xì)胞增殖和干細(xì)胞可塑性的信號(hào)通路和適應(yīng)性代謝網(wǎng)絡(luò)來(lái)維持腫瘤生長(zhǎng)。CSCs感知能量需求和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，并顯示出與其他腫瘤細(xì)胞不同的代謝途徑。代謝重編程是癌癥的標(biāo)志，它允許腫瘤細(xì)胞滿足快速細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移所需的增加的能量需求。值得注意的是，代謝重編程可防止癌細(xì)胞因化療引起的死亡而導(dǎo)致癌癥耐藥性。這在前列腺癌中尤其重要，其中脂質(zhì)信號(hào)失調(diào)會(huì)促進(jìn)生長(zhǎng)和肥胖，并被描述為與晚期或致命前列腺癌密切相關(guān)的危險(xiǎn)因素（Pernar等人，2018）。累積的證據(jù)表明，CSC的代謝適應(yīng)與散裝癌細(xì)胞中的代謝適應(yīng)不同，與正常組織干細(xì)胞中的代謝適應(yīng)非常相似（Kim，2019）。此外，誘導(dǎo)CSC的改變分化信號(hào)可能由參與干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)節(jié)的代謝事件控制（Menendez和Alarcon，2014）。例如，一些代謝物可以調(diào)節(jié)表觀遺傳變化，包括參與基因表達(dá)控制的組蛋白甲基化和乙?；⊿hyh-Chang和Ng，2017）。然而，對(duì)化療耐藥的CSC的代謝特征仍然難以捉摸。

代謝組學(xué)旨在使用化學(xué)計(jì)量學(xué)和統(tǒng)計(jì)工具來(lái)檢測(cè)、鑒定和量化生物樣品中的所有代謝物，以比較取決于遺傳和環(huán)境因素的不同生理?xiàng)l件的代謝指紋或代謝物譜（Dieme 等人，2017 年）。代謝組學(xué)提供有關(guān)特定條件下生物系統(tǒng)的生化狀態(tài)或代謝組的信息。該方法允許了解細(xì)胞，組織或生物體液中存在的低分子量化合物，這些化合物參與維持，生長(zhǎng)和細(xì)胞正常功能所需的不同代謝途徑（Fiehn，2002;張等， 2014;徐等人，2021 年）。此外，代謝譜隨時(shí)間變化，并在疾病的不同階段發(fā)生變化。代謝組學(xué)已開(kāi)始應(yīng)用于CSC研究，因?yàn)樗梢燥@示能量狀態(tài)，細(xì)胞增殖和適應(yīng)性，以及干細(xì)胞命運(yùn)選擇，例如自我更新與分化（Sun等人，2019）以及細(xì)胞與其環(huán)境之間的串?dāng)_（Bispo等人，2021）。

細(xì)胞、組織或生物流體中代謝物的檢測(cè)通常使用先進(jìn)的分析技術(shù)進(jìn)行，如核磁共振 （NMR） 波譜（Sciarra 等人，2011 年;利馬等人，2018 年;范德格里夫特等人，2018）或質(zhì)譜法（MS）（Zang等人，2014;塞格斯等人，2019 年;Sun 等人，2022 年）已成功應(yīng)用于前列腺癌研究。一般來(lái)說(shuō)，核磁共振波譜和質(zhì)譜，特別是液相色譜-高分辨率質(zhì)譜（LC-HRMS），是代謝組學(xué)研究中重要的兩個(gè)分析平臺(tái)。這兩種技術(shù)都提供了大量數(shù)據(jù)，需要統(tǒng)計(jì)分析來(lái)提取有關(guān)代謝反應(yīng)的相關(guān)和可靠的信息。主要挑戰(zhàn)之一是任何代謝組的復(fù)雜性，而“非靶向策略”適合建立生物系統(tǒng)中存在的代謝物的完整概況（“代謝指紋”）（Alonso等人，2015）。與核磁共振相比，MS的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)低得多濃度的代謝物的靈敏度更高，并且更適合高通量方法。此外，近年來(lái)，LC-HRMS技術(shù)由于其魯棒性和分辨率能力而越來(lái)越多地被使用。測(cè)定檢測(cè)到的離子的質(zhì)量/電荷比（m / z）的高分辨率以及MS中的專(zhuān)用數(shù)據(jù)庫(kù)允許搜索未知化合物并初步鑒定存在的代謝物。因此，今天LC-HRMS是進(jìn)行代謝組學(xué)研究的佳分析工具（Jayaraman等人，2018;馬丁-布拉茲克斯等人，2019 年;平托等人，2020 年）。

在這里，我們使用使用LC-HRMS的代謝組學(xué)方法，使用顯示CSC特征的癌細(xì)胞耐藥模型來(lái)了解與化療耐藥性相關(guān)的適應(yīng)性反應(yīng)。我們對(duì)代謝指紋圖譜和酶分析的綜合分析發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞具有低代謝率，其特征是低ADP-核糖基化和甲基化以及低線粒體脂肪酸β氧化。前列腺耐藥細(xì)胞中已確定的代謝途徑將允許開(kāi)發(fā)針對(duì)獲得耐藥性所涉及的機(jī)制的有效治療策略，值得進(jìn)一步研究。

討論

化學(xué)耐藥性是前列腺癌治療中具挑戰(zhàn)性的困難之一?；熌退幮园┌Y的高患病率使得我們迫切需要加深對(duì)化學(xué)耐藥機(jī)制的理解并開(kāi)發(fā)新的治療策略。在化學(xué)耐藥性的機(jī)制中，存在具有獨(dú)特性質(zhì)的癌癥干細(xì)胞，包括高多重耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，以及即使在化療藥物存在下也能維持腫瘤的自我更新能力。然而，雖然代謝重編程現(xiàn)在被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志（Fouad和Aanei，2017），但對(duì)CSCs可塑性背后的代謝途徑知之甚少，CSCs能夠處于休眠狀態(tài)，并且能夠在需要重新填充腫瘤塊時(shí)迅速增殖（Mancini等人，2018）。

癌癥干細(xì)胞是前列腺腫瘤中的一個(gè)重要亞群，主要負(fù)責(zé)抗雄激素治療耐藥性。在一項(xiàng)針對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，Tang 等人（Tang 等人，2022 年）根據(jù)其譜系可塑性和所涉及的轉(zhuǎn)錄因子確定了四個(gè)亞組。他們發(fā)現(xiàn)了一種干細(xì)胞樣（SCL）亞型，這是第二普遍的群體，并且與對(duì)新一代雄激素受體抑制劑的反應(yīng)較差有關(guān)。有趣的是，這些SCL腫瘤是陰性的或AR表達(dá)低（Tang等人，2022）。在另一項(xiàng)研究中，Han 等人發(fā)現(xiàn)了一種干細(xì)胞樣 PCa 亞型的轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌，該亞型由 AR 陽(yáng)性細(xì)胞引起，這是恩雜魯胺阻斷和治療誘導(dǎo)的譜系可塑性的結(jié)果（Han 等人，2022 年）。在這項(xiàng)研究中，我們使用了適合在抗雄激素2-羥基氟他胺存在下生長(zhǎng)的前列腺癌細(xì)胞系，該細(xì)胞系顯示出干細(xì)胞的特征，例如泵的增強(qiáng)表達(dá)，該泵將細(xì)胞內(nèi)積聚的藥物外排，ABCB1A，多能因子Nanog和Yamanaka因子Oct4的表達(dá)增加，以及AR水平低。值得注意的是， 這些細(xì)胞對(duì)化療藥物氟他胺和多西紫杉醇的敏感性較低，因此是研究與癌癥化療耐藥性相關(guān)的代謝變化的良好模型。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，脂質(zhì)和氨基酸代謝改變與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)（Yang等人，2022 年）。有報(bào)道稱(chēng)，轉(zhuǎn)移性卵巢癌干細(xì)胞表現(xiàn)出與原發(fā)性腫瘤不同的脂質(zhì)模式。這些細(xì)胞依靠脂肪自噬來(lái)利用脂質(zhì)，而不是傳統(tǒng)的脂解途徑，并且與原發(fā)性腫瘤相比，積累了許多細(xì)胞質(zhì)脂滴和脂質(zhì)囊泡（Sandeep 等人，2022 年）。同樣，造血干細(xì)胞依靠線粒體脂肪酸β氧化來(lái)調(diào)節(jié)分化。在對(duì)稱(chēng)分裂中自我更新的細(xì)胞具有更高水平的蛋白質(zhì)參與糧農(nóng)組織，而在不對(duì)稱(chēng)分裂中分化的細(xì)胞具有較低的水平（Ito等人，2016）。我們的結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞相比，抗癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中的脂肪酸β氧化減少，這表明它們可能正在經(jīng)歷不對(duì)稱(chēng)分裂以維持增殖的腫瘤細(xì)胞。

癌細(xì)胞因其高所需的蛋氨酸水平而與眾不同，這一事實(shí)被稱(chēng)為蛋氨酸成癮或霍夫曼效應(yīng)，正如霍夫描述的那樣（霍夫曼，1985;霍夫曼等人，2019 年）。人類(lèi)多能干細(xì)胞也使用高水平的蛋氨酸進(jìn)行蛋白質(zhì)合成和參與表觀遺傳調(diào)控的甲基化反應(yīng)。有趣的是，蛋氨酸和SAM是調(diào)節(jié)多能性和分化的關(guān)鍵因素。蛋氨酸剝奪誘導(dǎo)SAM水平降低，引發(fā)表觀遺傳變化，調(diào)節(jié)參與多能性的基因表達(dá)（Shiraki等人，2014）并使細(xì)胞保持靜止?fàn)顟B(tài)（Homma等人，2022）。我們的結(jié)果顯示精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT2的消耗和sDMA的升高表明抗性細(xì)胞中的精氨酸甲基化減少。這與先前描述PRMT抑制觸發(fā)胚胎成纖維細(xì)胞的Oct4依賴(lài)性重編程的結(jié)果非常吻合，這意味著抑制蛋白質(zhì)精氨酸甲基化可能是重編程過(guò)程的電感（Yuan等人，2011）。

總之，我們的結(jié)果表明，耐藥性前列腺癌細(xì)胞處于代謝休眠狀態(tài)，顯示出抑制脂肪酸氧化，蛋氨酸和ADP-核糖基化途徑。根據(jù)之前的假設(shè)（Shyh-Chang和Ng，2017），似乎長(zhǎng)期自我更新的干細(xì)胞在缺氧環(huán)境中保持其多能能力并下調(diào)線粒體活性（Han等人，2018）。此外，有人提出，在應(yīng)激條件下，癌細(xì)胞可以經(jīng)歷從增殖狀態(tài)到休眠狀態(tài)的表型轉(zhuǎn)變，其特征是無(wú)增殖、無(wú)死亡、無(wú)衰老、對(duì)化療耐藥、休眠標(biāo)志物高表達(dá)、代謝抑制和恢復(fù)到活動(dòng)狀態(tài)（莫拉萊斯-瓦倫西亞和大衛(wèi)，2022 年).事實(shí)上，腫瘤休眠是癌癥發(fā)展的關(guān)鍵階段，癌細(xì)胞可以保持隱匿性、無(wú)癥狀和對(duì)治療的抵抗力。腫瘤休眠細(xì)胞限制了化療的療效，化療主要針對(duì)高度分裂的細(xì)胞，導(dǎo)致復(fù)發(fā)和耐藥性。腫瘤細(xì)胞保持休眠并顯著重新出現(xiàn)的能力，對(duì)化療具有更積極的抵抗力，這是前列腺癌的特征（Cackowski 和 Heath，2022 年）。盡管腫瘤休眠在前列腺癌的化療耐藥性中很重要，但休眠進(jìn)入的機(jī)制和所涉及的代謝途徑在很大程度上仍未得到探索。在這項(xiàng)研究中，我們探索了對(duì)化療耐藥的前列腺癌細(xì)胞的代謝適應(yīng)。研究結(jié)果表明，Nanog的過(guò)表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞休眠有關(guān)（Cackowski等人，2017）。同樣，Zhang等人之前的一項(xiàng)研究表明，Nanog過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞休眠（Zhang等人，2022）。因此，我們的結(jié)果表明，化學(xué)耐藥性與Nanog的過(guò)表達(dá)和代謝關(guān)閉有關(guān)。這些結(jié)果揭示了支持癌細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)的途徑。然后，克服化學(xué)耐藥性的策略可能是通過(guò)重新連接在耐藥細(xì)胞中保持下調(diào)的代謝途徑來(lái)誘導(dǎo)休眠逃逸。

代謝組學(xué)的主要限制之一是鑒定未知代謝物。代謝物的鑒定通常不是一項(xiàng)成功的任務(wù)，并且通常只能明確鑒定少數(shù)代謝物。造成這個(gè)問(wèn)題有兩個(gè)原因，一是費(fèi)用過(guò)高或大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)不可用，二是在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中可以找到的信息有限。另一個(gè)強(qiáng)大的限制是缺乏能夠完全覆蓋代謝組的分析平臺(tái)，這是由于分析樣品中可能存在的廣譜代謝物的異質(zhì)性以及這些代謝物豐度的差異，因?yàn)樗鼈兊姆秶赡軓膒mol到mmol（九個(gè)數(shù)量級(jí)）。另一方面，該研究的另一個(gè)局限性是我們使用了獨(dú)特的抗性細(xì)胞系。盡管這使得樣品的均勻性在代謝組學(xué)分析中達(dá)到更好的準(zhǔn)確性，但使用耐藥細(xì)胞系與另一種不同的化療藥物相比，這項(xiàng)工作可能會(huì)獲得額外的相關(guān)性。