從發(fā)酵飲料中分離的酵母菌株產(chǎn)生具有抗炎作用的細(xì)胞外囊泡

細(xì)胞外囊泡（EVs）是脂質(zhì)雙層顆粒，含有各種生物分子，包括核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，由細(xì)胞從所有生命領(lǐng)域釋放并執(zhí)行多種通信功能。證據(jù)表明，宿主免疫細(xì)胞和真菌EVs之間的相互作用誘導(dǎo)了免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。大多數(shù)關(guān)于真菌EVs的研究都是在真菌感染的背景下進(jìn)行的；因此，在其他情況下酵母生產(chǎn)EVs而不是感染方面存在知識差距，這可能會影響人類健康。

近日，佛羅倫薩大學(xué)生物系和實(shí)驗(yàn)與臨床醫(yī)學(xué)系研究團(tuán)隊(duì)在國際知名nature子刊scientific reports上發(fā)表題為“Yeast strains isolated from fermented beverage produce extracellular vesicles with anti-inflammatory effects”的研究綜述。在這項(xiàng)研究中，該團(tuán)隊(duì)表征了從具有益生菌特性的發(fā)酵奶制品中分離的Saccharomyces cerevisiae和Pichia fermentans菌株獲得的EVs。在人類單核細(xì)胞衍生的子突狀細(xì)胞內(nèi)化后，通過免疫檢測，在體外研究了這些菌株產(chǎn)生的EV的免疫調(diào)節(jié)能力。結(jié)果顯示，用發(fā)酵牛奶EVs治療的樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞活性降低。EVs的小RNA部分主要包含酵母mRNA序列，在從發(fā)酵牛奶中分離出來的兩種不同物種的菌株中富含一些分子功能。結(jié)果表明，益生菌食品抗炎特性背后的機(jī)制之一可能由人類免疫細(xì)胞與酵母EVs的相互作用介導(dǎo)。

·實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、來自食源性酵母S. cerevisiae和P. fermentans的EVs表現(xiàn)出相似的結(jié)構(gòu)特征

通過納米粒子跟蹤分析（NTA）和透射電子顯微鏡（TEM）對EVs進(jìn)行分析。NTA測量顯示，不同酵母菌株的EVs中的尺寸相似（模式尺寸低于100納米），濃度（從9.8×1010到2.3×1011顆粒/毫升）和Zeta電位（低負(fù)值）。TEM分析顯示了酵母細(xì)胞外囊泡的典型杯狀形式和尺寸，研究人員捕捉到酵母細(xì)胞部分的圖像，其囊泡體穿過細(xì)胞壁。

2、酵母EVs影響人類DC的免疫原性

首先通過流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡評估了Mo-DCs的EVs內(nèi)吞作用。流式細(xì)胞儀分析顯示，Mo-DC在37°C（MFI = 452.66）下有效內(nèi)化EVs，而在4°C（MFI = 36.03）下觀察到內(nèi)化減少，用作內(nèi)吞作用陰性對照。為了進(jìn)一步確認(rèn)Mo-DCs對EV的吸收，并可視化DiI染色的EVs與細(xì)胞骨架F-肌動蛋白分布和細(xì)胞核有關(guān)，用共聚焦顯微鏡調(diào)查了樣品。內(nèi)胞DiI-EVs是可見的，主要分布在Mo-DCs細(xì)胞質(zhì)中，在37°C和4°C之間有明顯的差異，與流式細(xì)胞儀的觀察一致。

為了評估Mo-DCs與酵母EVs相互作用后的激活和功能，與脂多糖（LPS）激活的Mo-DCs和異基因T細(xì)胞進(jìn)行了混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）。在孵化4或24小時(shí)后，與對照組（LPS激活的Mo-DCs無EV）相比，LPS激活的Mo-DC與酵母EVs的培養(yǎng)減少了異基因T細(xì)胞的增殖（p值<0.05）。CL4（Sc）和CL1（Pf）樣本（來自發(fā)酵牛奶菌株的EVs）比實(shí)驗(yàn)室菌株ts9（Sc）對Mo-DCs功能造成更強(qiáng)的損害。隨著Mo-DCs濃度的增加（5×103和104），這種效果更加一致，這表明劑量依賴性。此外，1:20稀釋平均比1:200稀釋略有效。

3、小RNA含量根據(jù)酵母分離來源而變化

在對EVs進(jìn)行RNA酶處理以排除細(xì)胞RNA結(jié)轉(zhuǎn)的污染后，從3個(gè)酵母菌株的3個(gè)EVs復(fù)制品中提取小RNA餾分（<200 nt），然后進(jìn)行測序。質(zhì)量控制（QC）分析證實(shí)存在小RNA峰值和大量RNA。在質(zhì)量過濾步驟后，超過75%的來自Saccharomyces cerevisiae-（CL4和ts9）和Pichia發(fā)酵劑衍生的EVs（CL1）的原始序列被保留，而K-樣本報(bào)告的值較低。核糖體序列分析導(dǎo)致刪除了約50%的ts9和CL4讀數(shù)（Sc），而保留了75%以上的CL1（Pf）序列。

事實(shí)證明，EVs主要包含真菌mRNA的片段，只有一小部分非編碼序列。根據(jù)人類基因組映射這些序列也導(dǎo)致了人類mRNA序列的相對大多數(shù)，但對EVs復(fù)制之間一致性的分析顯示，在人類mRNA上映射的大多數(shù)序列只存在于一個(gè)復(fù)制中。

差異豐富基因的富集分析表明，三種酵母菌株的EVs富含逆轉(zhuǎn)錄酶核衣殼細(xì)胞成分，而其他六種分子功能僅由Saccharomyces cerevisiae CL4和Pichia fermentans CL1共享。

富集的細(xì)胞成分GO：0,000,943與Ty類基因編碼的逆轉(zhuǎn)錄核衣殼相關(guān)，表明囊泡中可轉(zhuǎn)座序列的富集。此外，功能00,003,964編碼具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的基于RNA的DNA聚合酶，其他DNA聚合酶基因僅存在于發(fā)酵牛奶分離菌株中，但不存在于S. cerevisiae ts9菌株中。

綜上所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為非致病性酵母EVs作為在幾種人類條件下輸送免疫調(diào)節(jié)分子的合適候選藥物的潛在臨床應(yīng)用提供了見解。