病毒樣顆粒疫苗：基因工程時(shí)代的另一個(gè)抗疫英雄

您是否曾想過(guò)有這樣一類(lèi)疫苗，既能對(duì)抗各種致命病毒，又無(wú)需擔(dān)心可能帶來(lái)的副作用？答案就是--VLPs（Virus-Like Particles）病毒樣顆粒疫苗。

什么是VLPs？

VLPs是由病毒單一或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高度結(jié)構(gòu)化的蛋白顆粒，大多數(shù)VLPs的空殼結(jié)構(gòu)為二十面體或螺旋形結(jié)構(gòu)，由幾種特異的結(jié)構(gòu)蛋白組成，它們有著和真正病毒十分相似的特征，易于被免疫系統(tǒng)識(shí)別，并以與真實(shí)構(gòu)象相似的途徑呈遞病毒抗原，從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，但卻不含有病毒的遺傳物質(zhì)，因此無(wú)法復(fù)制或引發(fā)疾病[1]。簡(jiǎn)單地說(shuō)，VLPs疫苗提供了讓免疫系統(tǒng)"模擬演練"的機(jī)會(huì)，以便在遇到真正的病毒時(shí)能立即作出反應(yīng)進(jìn)行反擊，并且VLPs疫苗自帶佐劑效應(yīng)，相當(dāng)于"打游戲自帶外掛"。您是否曾想過(guò)有這樣一類(lèi)疫苗，既能對(duì)抗各種致命病毒，又無(wú)需擔(dān)心可能帶來(lái)的副作用？答案就是--VLPs（Virus-Like Particles）病毒樣顆粒疫苗。

VLPs作為亞單位疫苗的一種，因具有安全、高效、可實(shí)現(xiàn)鑒別診斷的突出優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)也被認(rèn)為是有可能替代傳統(tǒng)滅活疫苗的佳候選疫苗形式。VLPs疫苗的制備過(guò)程一般包括以下步驟:病毒結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建與克隆、宿主表達(dá)系統(tǒng)選擇、分離純化、分析鑒定等[2]。

VLPs疫苗的分類(lèi)

根據(jù)原始病毒的結(jié)構(gòu)，VLPs疫苗可分為有包膜和無(wú)包膜兩類(lèi)。無(wú)包膜的VLPs疫苗只包含由病毒的蛋白形成的顆粒，如諾瓦克病毒和戊型肝炎病毒，一般由原核表達(dá)系統(tǒng)和低級(jí)真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。有包膜的病毒除了病毒本身的蛋白外，還包含宿主的細(xì)胞膜，比如A型流感病毒和乙型肝炎病毒，一般由真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

VLPs疫苗優(yōu)勢(shì)在哪？

1）、安全性：VLPs不含復(fù)制酶和編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸，缺乏復(fù)制能力；

2）、高效的免疫保護(hù)力：VLPs自組裝疫苗能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性的抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，提供長(zhǎng)期、持久的免疫保護(hù);

3）、廣泛適應(yīng)性：VLPs自組裝疫苗可針對(duì)不同病原體進(jìn)行設(shè)計(jì)，包括病毒、細(xì)菌等，為多種傳染病的預(yù)防和治療提供了新的選擇；

4）、表達(dá)系統(tǒng)多樣性：大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和植物等多種表達(dá)體系均可用于表達(dá)VLPs；

5）、穩(wěn)定性和易制備性：VLPs疫苗具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，能夠在極端條件下保存，容易通過(guò)工程方法大規(guī)模制備，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn)。

這么優(yōu)的疫苗，以前怎么沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò)？

其實(shí)不然，20世紀(jì)80年代以來(lái)，VLPs逐漸替代傳統(tǒng)疫苗成為疫苗制備的首[3]，并且作為炎癥、疼痛、過(guò)敏、腫瘤等治療性疫苗，早已滲透在我們的生活當(dāng)中。例如乙肝疫苗、戊肝疫苗、宮頸癌疫苗和流感疫苗等都是"現(xiàn)役"經(jīng)典的VLPs疫苗，并且由默沙東開(kāi)發(fā)的乙型肝炎病毒（HBV，簡(jiǎn)稱(chēng)乙肝）疫苗作為全球首VLPs疫苗早在1986年就已獲批上市，隨后以預(yù)防人乳頭瘤病毒、戊型肝炎病毒等為適應(yīng)癥的預(yù)防疫苗相繼上市。

VLPs疫苗的表達(dá)系統(tǒng)

VLPs常用表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌、桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等，約有170種不同的宿主表達(dá)系統(tǒng)可用，目前已報(bào)導(dǎo)的VLPs疫苗約70％基于真核表達(dá)系統(tǒng)，30％基于原核表達(dá)系統(tǒng)，并且已有100余種VLPs被制備及鑒定。

VLPs疫苗的純化與組裝

病毒樣顆粒的純化主要包括4個(gè)步驟，分別是裂解、粗提、濃縮和精制[4]。

1、裂解：當(dāng)宿主表達(dá)的組裝VLPs無(wú)法分泌至胞外時(shí)，純化時(shí)需要先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解[5]，哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞一般采用去污劑處理，而高壓、超聲、研磨以及凍融等方法[6-7]則多用于細(xì)菌、酵母和植物細(xì)胞。裂解過(guò)程中重要的是防止蛋白降解，因此需要根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)選擇合適的緩沖體系，并添加蛋白酶抑制劑和蛋白穩(wěn)定劑［8］。

2、粗提：這一步是將細(xì)胞碎片和大聚合物去掉[9]。離心是蛋白粗提過(guò)程中常用的方法，一般使用低速離心機(jī)或者連續(xù)流離心機(jī)[5]。

3、濃縮：這一步主要的目的是去除雜蛋白和提高目的蛋白濃度。濃縮的方法有很多，包括硫酸銨沉淀、聚乙二醇沉淀、蔗糖氯化銫梯度超速離心、離子交換層析、疏水層析及親和層析等[10]。

4、精純：精制的主要目的是去除宿主自身表達(dá)的蛋白質(zhì)和DNA，同時(shí)去除工藝過(guò)程引入的雜質(zhì)。精純主要采取離子交換層析、膜裝置和分子排阻等方法。

5、組裝：由于不完全或者不規(guī)則的組裝會(huì)導(dǎo)致VLPs疫苗效果的下降，因此，有時(shí)需要對(duì)VLPs進(jìn)行去組裝和重組裝處理，以提高VLPs的穩(wěn)定性、均一性和免疫原性[11]。而且需要根據(jù)VLPs自身性質(zhì)選擇合適緩沖體系，例如HPV16L1 VLPs的去組裝需要在高pH、低鹽和還原劑的溶液下進(jìn)行，重組裝則需要在低pH、高鹽和去還原劑的條件下進(jìn)行[9]。

病毒樣顆粒的鑒定

在制備VLPs的過(guò)程中，要對(duì)VLPs的制備情況進(jìn)行檢測(cè)，主要通過(guò)以下4個(gè)方面：性質(zhì)、含量、效果和純度。

1、性質(zhì)：VLPs性質(zhì)的檢測(cè)主要包括VLPs的形態(tài)、大小、氨基酸序列、相對(duì)分子質(zhì)量、降解修飾情況、中和表位、抗原特異性等方面[12]。方法包括SDS/PAGE法、Western Blot法、ELISA法、表面等離子體共振技術(shù)、投射電子顯微鏡法、免疫電鏡法、蛋白質(zhì)測(cè)序法、質(zhì)譜法等。

2、含量：主要的方法有ELISA法、BCA法、Bradford法、紫外分光光度法等。

3、效力：證明VLPs疫苗效果的關(guān)鍵，主要包括體外試驗(yàn)，如血凝抑制試驗(yàn)；體內(nèi)試驗(yàn)，如免疫試驗(yàn)、攻毒試驗(yàn)等。

4、純度：檢測(cè)純化和精制效果的關(guān)鍵，同時(shí)也與能否用于臨床試驗(yàn)相關(guān)。純度檢測(cè)主要檢測(cè)VLPs結(jié)構(gòu)蛋白的純度、VLPs的組裝率、宿主DNA和蛋白的殘余、蛋白核酸復(fù)合物的多少等。主要的方法有ELISA法、SDS/PAGE法、DNA染色方法、瓊脂糖凝膠電泳遲滯試驗(yàn)、透射電鏡檢測(cè)法等[8]。

VLPs疫苗的未來(lái)

VLPs疫苗，作為一種無(wú)活性、高效率的疫苗制備方式，正在改變我們對(duì)未來(lái)免疫防御的認(rèn)知。同時(shí)由于其對(duì)目標(biāo)宿主細(xì)胞的天然親和力特性已被用于如基因治療、靶向給藥等細(xì)胞靶向應(yīng)用，也可與探針結(jié)合應(yīng)用于生物成像或揭示病毒感染機(jī)制等基礎(chǔ)研究當(dāng)中，VLPs代表著免疫科學(xué)的前端進(jìn)展，提供了一種強(qiáng)大且安全的工具為人類(lèi)健康做貢獻(xiàn)。