IGF1和IGF2表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

【摘要】  目的 研究胰島素樣生長因子1和2（IGF1、IGF2，合稱為IGFs）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中的表達(dá)，探討其與NSCLC區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 采用免疫組織化學(xué)和免疫印跡技術(shù)檢測IGF1和IGF2在65例NSCLC、29例癌旁肺組織和19例良性肺病變組織中的表達(dá)。結(jié)果 IGF1和IGF2在NSCLC中的表達(dá)率顯著高于良性肺組織。IGF1和IGF2在伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌中的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌組織。IGF1和IGF2在伴有N2或≥5個轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)肺癌組織中的表達(dá)顯著高于在僅伴有N1或<5個轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)肺癌組織。IGF2在伴有多組轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)肺癌組織中的表達(dá)顯著高于僅有一組轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)肺癌組織。結(jié)論 IGFs不僅在NSCLC中過表達(dá)，而且與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的部位、數(shù)量及組數(shù)相關(guān)聯(lián)，提示IGFs在NSCLC發(fā)生和發(fā)展中可能起重要作用，IGFs為NSCLC生物學(xué)行為尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷提供一個新的有意義的指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】  非小細(xì)胞肺癌 轉(zhuǎn)移 胰島素樣生長因子1 胰島素樣生長因子2 疫組織化學(xué)

　　0  引言
   
　　區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）預(yù)后的重要因素[13]，其發(fā)生受到某些腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控。胰島素樣生長因子(Insulinlike growth factor, IGF)包括兩個類型，即IGF1和IGF2（合稱為IGFs），它們促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用越來越受關(guān)注[4]。近研究表明，IGFs在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中可能起重要作用[57]，但有關(guān)IGFs蛋白在NSCLC中表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚無報道。為此，本研究采用免疫組織化學(xué)方法及免疫印跡技術(shù)檢測IGF1和IGF2在NSCLC組織中的表達(dá)，并探討其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

　　1  資料與方法

　　1.1  臨床資料
   
　　65例肺癌標(biāo)本為武漢同濟(jì)醫(yī)院1999～2001年因原發(fā)性肺癌而手術(shù)切除標(biāo)本。所有病例術(shù)前未行放療或化療，無代謝性疾病。男35例,女20例；年齡36～71（57±8.9）歲；鱗癌37例，腺癌28例。按PTNM分類標(biāo)準(zhǔn)(UICC,1997):Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期21例，Ⅳ期9例。伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例（為N1或N2轉(zhuǎn)移，無N3轉(zhuǎn)移病例），無轉(zhuǎn)移24例。29例切片中含有癌旁肺組織。以同期手術(shù)切除的19例肺良性病變組織(非癌性)作對照；其中，男14例，女5例；肺炎性假瘤9例，支氣管擴(kuò)張癥6例，肺錯構(gòu)瘤2例，肺平滑肌瘤2例。每例標(biāo)本離體后分成2小份；1份甲醛固定后石蠟包埋，1份液氮速凍后轉(zhuǎn)－80℃冰箱保存。用石蠟標(biāo)本做連續(xù)切片,其中1張行HE染色,進(jìn)一步核實原診斷，并作為組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)用于評價IGF1和IGF2免疫組織化學(xué)染色。
   
　　淋巴結(jié)標(biāo)本：肺癌區(qū)域淋巴結(jié)分組方法按1997年公布的標(biāo)準(zhǔn)[1]。肺癌手術(shù)中常規(guī)清掃胸內(nèi)區(qū)域淋巴結(jié)，按暴露的先后和容易程度及術(shù)者的習(xí)慣，在肺葉切除術(shù)中,一般先清掃1、10組和部分9、12組淋巴結(jié)；在全肺切除術(shù)中,則先清掃10、9組和部分7、5組淋巴結(jié)，切除并移出肺標(biāo)本后,再剪開縱隔胸膜清掃上、下縱隔各組淋巴結(jié)。肺內(nèi)淋巴結(jié)則在術(shù)后從肺標(biāo)本中取出。各組淋巴結(jié)標(biāo)記后分別送病理檢查,以診斷有無癌轉(zhuǎn)移。

　　1.2  免疫組織化學(xué)染色
   
　　采用抗生物素生物素堿性磷酸酶標(biāo)記的免疫染色法（ABCAP法）。切片脫蠟水化，置入檸檬酸緩沖液內(nèi)，用高壓鍋加熱達(dá)滿壓力后再持續(xù)1.5s。冷卻，TBS緩沖液沖洗。血清封閉后，分別滴加鼠抗人單克隆IGF抗體(美國Upstate Biotechnology產(chǎn)品)：抗IGF1抗體Clone Sm1.2，濃度為5μg/ml；抗IGF2抗體Clone S1F2，濃度為8.3μg/ml。4℃冰箱過夜。加生物素化猴抗鼠IgG(德國Dianova產(chǎn)品)。加抗生物素堿性磷酸酶復(fù)合物(美國Vector Laboratories Inc產(chǎn)品)。以ASBI磷酸鹽萘酚作為底物，以新品紅作為色原體顯現(xiàn)組織中的免疫反應(yīng)。常規(guī)脫水、透明、封片。每次實驗設(shè)陽性和陰性對照。IGFs免疫組織化學(xué)反應(yīng)的評價標(biāo)準(zhǔn)：無著色或弱著色細(xì)胞<5%為陰性；明顯著色且著色細(xì)胞≥5％為陽性。

　　1.3  免疫印跡技術(shù)
   
　　采用顯微分離技術(shù)，將冷凍標(biāo)本中的惡性肺組織分離并融化。將蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳展開，再電轉(zhuǎn)印于PVDF膜上。用與免疫組織化學(xué)染色相同的抗IGF1或IGF2抗體（濃度均為1μg/ml）與膜在室溫下孵化2h。再與過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG抗體(1∶2 000)作用。采用增強化學(xué)發(fā)光法檢測膜免疫反應(yīng)條帶。

　　1.4  分組與統(tǒng)計分析
   
　　將病例按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分為有或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；其中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組參照文獻(xiàn)[3]并結(jié)合本研究資料分布特點，進(jìn)一步按淋巴結(jié)分期分為N1和N2組，按轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個數(shù)分為<5和≥5個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組數(shù)分為一組和多組轉(zhuǎn)移。用卡方檢驗檢測組間IGF1和IGF2表達(dá)的差異性，如P<0.05，則認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2  結(jié)果

　　2.1  IGF1和IGF2免疫反應(yīng)特性
   
　　與陽性對照結(jié)果一致，IGF1和IGF2在肺組織中的表達(dá)位于胞漿，見圖1、2。在陰性對照組織中無IGF1或IGF2著色。免疫印跡實驗在免疫組織化學(xué)IGF1和IGF2陽性對應(yīng)肺癌組織中分別檢測出對應(yīng)分子量為7.7和7.5kDa的蛋白條帶，見圖3。

　　2.2  IGF1、IGF2在良性肺組織和肺癌組織中的表達(dá)
   
　　IGF1和IGF2在肺良性病變組織中的表達(dá)率為15.8％(3/19)和21.0％（4/19），在癌旁肺組織中的表達(dá)率為13.8％（4/29）和20.7％(6/29)，在肺癌組織中的表達(dá)率為44.6％（29/65）和50.8％（33/65）。IGF1、IGF2在良性肺病變組織和癌旁肺組織中的表達(dá)無顯著性差異，但均顯著低于肺癌組織中的表達(dá)（IGF1的P分別為0.0228和0.0038，IGF2的P分別為0.0217和0.0063）。

　　2.3  IGF1、IGF2表達(dá)與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

　　1A：IGF1在肺鱗癌中表達(dá)(ABCAP法 ×250)；2A：IGF2在肺鱗癌中表達(dá) (ABCAP法 ×350)

　　1B：IGF1在肺腺癌中表達(dá)(ABCAP法 ×300)；2B：IGF2在肺腺癌中表達(dá) (ABCAP法 ×300)

　　圖1  IGF1在NSCLC組織中表達(dá)圖2  IGF2在NSCLC組織中表達(dá)（略）

　　用免疫組織化學(xué)IGF1或IGF2陽性的肺癌組織(T)做免疫印跡實驗，檢測出分子量為7.7kDa(A)或7.5kDa(B)的蛋白條帶；T1～T5：病例序號

　　圖3  免疫印跡實驗檢測結(jié)果
   
　　IGF1和IGF2在伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌中的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌組織。IGF1和IGF2在伴有N2或≥5個轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)肺癌組織中的表達(dá)顯著高于在僅伴有N1或<5個轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)肺癌組織。IGF2在伴有多組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌組織中的表達(dá)顯著高于僅有一組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌組織，但I(xiàn)GF1在伴有一組或多組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌組織中的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

　　表1  IGF1、IGF2表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系（略）

　　3  討論
   
　　本研究所用一抗是抗人IGF1和IGF2單克隆抗體，其特異性已在很多研究中得到證實。本研究采用陽性、陰性對照方法也證實了所做免疫反應(yīng)和所使用抗體的特異性，此外，采用相同的抗體做免疫印跡實驗，能在免疫組織化學(xué)IGF1和IGF2陽性的組織中檢測出特異性的IGF1和IGF2蛋白條帶，進(jìn)一步證實了本研究結(jié)果的特異性。
   
　　研究發(fā)現(xiàn)IGFs mRNA在人非小細(xì)胞肺癌體外培養(yǎng)細(xì)胞系[6]和人體肺癌組織[5,8]中表達(dá)。與之相符，本研究發(fā)現(xiàn)，IGFs蛋白在NSCLC中過表達(dá)，這些結(jié)果提示IGFs在肺癌的發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要作用。
   
　　本研究發(fā)現(xiàn)，IGF1和IGF2表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P分別為0.0149和0.0077)，提示IGFs在肺癌轉(zhuǎn)移中可能起重要作用。腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的基本要素和先決條件是瘤細(xì)胞不斷增殖的能力。IGFs通過自分泌和旁分泌方式在肺癌組織中表達(dá)，與胰島素樣生長因子I受體結(jié)合后激活MAPK和PI3K/AKT兩條重要的信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和抗凋亡[4,7,9]。我們的研究[10]和近不少研究[4,79]表明，這兩條信號通路在肺癌發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，甚至可能是治療肺癌的有效靶點。事實上，IGFs對包括肺癌細(xì)胞在內(nèi)的許多腫瘤細(xì)胞具有強有力的刺激增殖作用[4,6,7]。因此，IGFs通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗凋亡在NSCLC轉(zhuǎn)移中可能起著重要作用。
   
　　此外，本研究在進(jìn)一步分析IGFs表達(dá)與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部位的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，伴有N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌的IGFs表達(dá)顯著高于僅伴N1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌，進(jìn)一步提示IGFs在肺癌轉(zhuǎn)移中起重要作用，這一結(jié)果反過來也為肺癌淋巴結(jié)分期提供分子生物學(xué)依據(jù)。但目前的淋巴結(jié)分期標(biāo)準(zhǔn)僅考慮淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的部位及范圍，而沒有考慮轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的數(shù)量；研究表明，肺癌的預(yù)后與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的部位和數(shù)量均顯著相關(guān)[2,3]。本研究發(fā)現(xiàn)，IGFs在伴有5個或以上轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)肺癌組織中的表達(dá)顯著高于僅伴有5個以下轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)肺癌組織；相似地，IGFs在伴有多組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌組織中的表達(dá)顯著高于僅有一組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺癌組織，提示IGFs表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的部位、范圍、數(shù)量及組數(shù)均有關(guān)系，因此，檢測IGFs表達(dá)將有助于判斷肺癌的生物學(xué)行為。
   
　　綜上所述，IGFs不僅在非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá)，而且與其區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)，提示IGFs在NSCLC發(fā)生和發(fā)展中可能起重要作用，IGFs為肺癌生物學(xué)行為尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷提供一個新的有意義的指標(biāo)。

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