人工關(guān)節(jié)金屬磨損顆粒體外制備分離方法的實(shí)驗(yàn)研究

【摘要】  設(shè)計(jì)一種體外制備、分離人工關(guān)節(jié)金屬磨損顆粒的方法，并驗(yàn)證這種顆粒用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的可行性。［方法］用鈦鋁釩合金、鈷鉻鉬合金材料分別制成球磨罐(國家發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枺?3142073. 7), 球磨罐內(nèi)裝有用同種材料制成的磨塊; 向該球磨罐內(nèi)注入模擬生物體液; 震動(dòng)球磨得到顆粒混懸液。梯度離心獲得金屬顆粒。對(duì)顆粒進(jìn)行：(1)元素成分鑒定；(2)顆粒大小鑒定和粒度分析；(3)掃描電鏡對(duì)顆粒的表面形態(tài)觀察；(4)將顆粒與J774A. 1巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察細(xì)胞吞噬顆粒的情況。［結(jié)果］通過此方法成功產(chǎn)生并分離出大量直徑1 μm左右的鈦合金和鈷鉻鉬合金顆粒。(1)元素分析證實(shí)整個(gè)處理過程中無雜質(zhì)成分污染；(2)鈦合金顆粒的平均直徑Dv90∶1. 009，鈷鉻鉬顆粒的平均直徑Dv90∶1. 008，粒度分布曲線基本成正態(tài)；(3)掃描電鏡圖象顯示顆粒大小均勻，形狀多為不規(guī)則，與體內(nèi)顆粒極為相似；(4)J774A. 1巨噬細(xì)胞能完整吞噬2種材料的顆粒。［結(jié)論］此方法能持續(xù)大量產(chǎn)生人工關(guān)節(jié)假體金屬材料的磨損顆粒，產(chǎn)生的顆粒能在各方面很好地模擬體內(nèi)磨損顆粒，為今后人工關(guān)節(jié)假體松動(dòng)相關(guān)研究的體內(nèi)、體外研究提供可靠的顆粒來源。

【關(guān)鍵詞】  人工關(guān)節(jié) 生物相容性材料 磨損顆粒 體內(nèi)研究 體外研究

    Experimental study on a method of in vitro preparation and seperation for me[x]tallic prosthesis wear particles∥JIA Qingwei, TANG Tingting, YAN Mengning, et al. Department of Orthopedic Surgery,the 9th Affiliated Hospital of Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200011,China

    Abstract：［ob[x]jective］To design a method of in vitro preparation and seperation for me[x]tallic wear particles around joint prosthesis and evaluate its feasibility in medical experiments. ［Method］Ti-6Al-4V and Co-Gr-Mo alloys were used to make two friction jars respectirely. National inventive patent applied number 03142073.7.Lots of quadrate blocks made of the same materials  are put into the jars respectively, which were then. lubri cated by manmade body fluid and vibrated on a bottle shaker. After 21 days the fluid was harvested and centrifuged to get the produced wear particles. The collected particles  were studied by using element trace analysis, laser countersizer and scanning electron microscopy. The J774.A1 macrophages cultured together with these particles for 24 hours were observed under inverted phase contrast microscopy and transmission electron microscopy.［Result］A got great amounts of me[x]tallic particles with  1μm diameter coned beproduce using this method. The aver age diameter of titanium alloys (Dv90) is 1.011 and that of CoGrMo is 1.010. Particle size distribution had good consistency in different materials. Under scanning electron microscopy ,the particles had irregular shapes just like those got from revision operations. The particles taken into the J774.A1 macrophages could be seen under inverted p hase contrast microscopy and transmission electron microscopy.［Conclusion］This method is good enough to producl lots of me[x]tallic wear particles mosth like those around total joint prosthesis and  can be used in further in vivo and in vitro studies about  joint prosthesis loosening.

    Key words：artifitial joint;    biomechanical  receptive material;    wear particle;    in vivo;    in vitro

      人工關(guān)節(jié)假體晚期松動(dòng)是長期困擾骨科領(lǐng)域的難題。長期的研究形成共識(shí)：假體材料磨損顆粒引發(fā)的由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞性骨吸收是假體松動(dòng)的主要生物學(xué)原因［1］。隨著各種新型生物金屬材料的不斷產(chǎn)生和人們對(duì)金屬-金屬人工關(guān)節(jié)假體的重新評(píng)價(jià)，細(xì)小金屬顆粒在假體松動(dòng)中的作用又成為了研究的熱點(diǎn)［2，3］。為解決人工關(guān)節(jié)松動(dòng)相關(guān)研究中顆粒來源匱乏的問題，本研究在參考Rogers［4］方法的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出一種體外產(chǎn)生生物金屬材料細(xì)小磨損顆粒的方法，采用此方法成功制成了直徑1 μm的鈦合金和鈷鉻鉬合金顆粒。并對(duì)顆粒的成份、大小、形態(tài)和粒度分布進(jìn)行分析觀察。顆粒與巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)中觀察吞噬的方法初步驗(yàn)證顆粒用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的可行性。

    1    材料與方法

    1.  1    顆粒制備裝置的研制

    原料選用醫(yī)用鈦鋁釩合金（上海思愛高科技開發(fā)有限公司提供）和鈷鉻鉬合金（北京力達(dá)康科技有限公司提供）。采用非焊接技術(shù)制成3個(gè)中空的橢球形球磨罐（100 mm×70 mm×70 mm）和立方形磨塊若干（5 mm×5 mm×5 mm）。頂部開口處采用螺紋旋入式頂蓋，加用聚乙烯的墊圈，以提高系統(tǒng)的密封性能，在設(shè)計(jì)上確保聚乙烯墊圈不外露于容器的內(nèi)壁，以防止混入聚乙烯磨損顆粒。底部支架使磨罐能在平面放置（圖1、2）。本裝置的所有組件按ASTM F86-76標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行清洗，75%酒精浸泡，高溫滅菌（121℃、15 min）后備用。

    生物金屬顆粒產(chǎn)生裝置及分離保存方法已申請(qǐng)國家發(fā)明專利。

    發(fā)明名稱：一種生物金屬材料超細(xì)粉末的制備方法及其制備裝置。

    專利申請(qǐng)?zhí)枺?3142073.  7

    1.  2    磨損顆粒的制備、離心分離與保存

    無菌條件下打開頂蓋，將磨塊放入球磨罐中，加入事先配制好模擬生物體液（PBS+2%小牛血清+5 IU/ml青霉素+5 μg/ml鏈霉素）75 ml作為潤滑液。裝置至于搖床上，搖晃72 h，棄掉潤滑液，重新加入潤滑液75 ml，搖晃21 d。收集潤滑液與磨損顆粒的混懸液，加潤滑液至80 ml待用。

    將鈷鉻鉬合金混懸液80 ml分裝在8個(gè)10 ml的試管中，500 r/min離心2 min，棄沉淀物，重新加潤滑液至10 ml，重復(fù)2次。1 000  r/min離心5 min，棄上清，重新加潤滑液至10 ml, 重復(fù)1 000  r/min離心5 min 1次，加潤滑液至4 ml, -20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    將鈦合金混懸液80 ml分裝在8個(gè)10 ml的試管中，500  r/min離心4 min，棄沉淀物，重新加潤滑液至10 ml，重復(fù)2次。1 000  r/min離心40 min，棄上清，重新加潤滑液至10 ml, 重復(fù)1 000  r/min離心40 min一次，加潤滑液至4 ml, -20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.  3    磨損顆粒成分元素分析

    隨機(jī)抽樣選取鈦鋁釩合金原料和磨損顆粒樣品各一份進(jìn)行元素分析。秤取0.  1 g原料和磨損顆粒樣品，于聚四氟乙烯燒杯中，加入10 ml HF（分析純），加熱1 h，加入10 ml H2SO4(GR), 加熱1 h，定容于500 ml容量瓶中。取液進(jìn)入等離子體發(fā)射光譜儀（IRIS Advantage 1000 美國），儀器自動(dòng)讀出樣品元素組成。

    1.  4    磨損顆粒的粒度分析

    用潤滑液（PBS+2%小牛血清+5 IU/ml青霉素+5 μg/ml鏈霉素）進(jìn)入激光粒度儀（TSL100 上海理工大學(xué)研制）校準(zhǔn)調(diào)零。取顆?；鞈乙? ml, 在旋渦混合器上充分混勻，進(jìn)入激光粒度儀，計(jì)算機(jī)自動(dòng)顆粒濃度、粒度數(shù)據(jù)和粒度分布曲線。

    1.  5    磨損顆粒的掃描電鏡觀察

    取顆?；鞈乙?0 ml，滴加到孔徑為0.  22 μm的濾膜上，烘干48 h后表面真空離子噴金，掃描電子顯微鏡（QUANTA200 荷蘭）進(jìn)行觀察并攝取圖像。

    1.  6    巨噬細(xì)胞培養(yǎng)與吞噬實(shí)驗(yàn)

    J774A.  1巨噬細(xì)胞株來源于BALB/c小鼠網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤，由American Type Culture Collection Co. （Rockville, MD, USA）提供，培養(yǎng)在含10%小牛血清、100 μg /ml青霉素、100 μg /ml鏈霉素和2%谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105/ml接種于6孔板中，培養(yǎng)4～6　h后，加入體外制備的鈷鉻鉬合金顆?；鞈乙海?07個(gè)/孔），另外于35 mm培養(yǎng)皿中按上述方法接種細(xì)胞，刺激24 h后用2.  5%戊二醛溶液固定，進(jìn)行倒置相差顯微鏡觀察。同時(shí)設(shè)置不加任何刺激物的對(duì)照孔。

    1.  7    巨噬細(xì)胞透射電鏡觀察

    J774A.  1巨噬細(xì)胞分別加入鈷鉻鉬合金顆?；鞈乙汉外佷X釩合金顆粒混懸液（107個(gè)/孔），作用24 h后用2.  5%戊二醛溶液固定。用橡皮刮子將全部細(xì)胞從皿底輕輕刮下，收集在離心管中離心2 000  r/min 20 min，棄上清，將沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊取出，用棉花紙包裹起來，然后進(jìn)行漂洗、1%鋨酸后固定15 min、漂洗、脫水、浸透，將樣品從棉花紙內(nèi)取出進(jìn)行包埋，60℃烘箱內(nèi)48 h，超薄切片，透射電鏡（HITACHI H-500 日本）觀察并攝像。

    2    結(jié)    果

    2.  1    磨損顆粒成分元素分析

    分析結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)中獲得的鈦鋁釩合金顆粒的元素構(gòu)成與其原料基本相同（表1），證實(shí)磨損顆粒的產(chǎn)生過程中無雜質(zhì)元素污染。 表1    鈦鋁釩合金磨損顆粒的元素分析結(jié)果

    2.  2    磨損顆粒的粒度分析

    鈦鋁釩顆粒的平均直徑Dv90∶1.  009，99.  93%的顆粒直徑在0.  3～1.  2 μm之間；鈷鉻鉬顆粒的平均直徑Dv90∶1.  008，99.  93%的顆粒直徑在0.  3～1.  2 μm之間；2種顆粒粒度分布曲線形態(tài)非常相似（圖3、4）。

    2.  3    磨損顆粒的掃描電鏡觀察

    鏡下可見體外制備的鈦鋁釩合金顆粒呈片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)則形狀，表面有低密度的血清蛋白沉積（圖5）。未見明顯的顆粒疊加和成團(tuán)聚集的情況。大小顆粒在濾膜上分布不均勻，大顆粒集中在邊緣上，小顆粒集中在中心部位。

    體外制造的鈷鉻鉬合金顆粒也有片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)則形狀，鈷鉻鉬合金顆粒更多為塊狀顆粒，是由于顆粒輕度聚集，顯得體積更大（圖6）。

    與體內(nèi)分離顆粒對(duì)照發(fā)現(xiàn)，顆粒的形態(tài)均非常近似，表面都有蛋白沉積。體內(nèi)分離顆粒大小分布更加不均勻（圖 7）。

    2.  4    巨噬細(xì)胞培養(yǎng)與吞噬實(shí)驗(yàn)

    J774A.  1巨噬細(xì)胞經(jīng)合適的條件培養(yǎng)24 h后細(xì)胞生長旺盛，吞噬活性較強(qiáng)。倒置相差顯微鏡下細(xì)胞成圓形或橢圓形，細(xì)胞輪廓清晰，胞漿內(nèi)無明顯吞噬小體（圖8）。與體外制備的鈷鉻鉬顆粒共同培養(yǎng)24 h后，鏡下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。細(xì)胞密度減小，細(xì)胞腫脹成圓形，胞核變大，甚至見到細(xì)胞大片壞死，核溶解，細(xì)胞碎裂，胞漿內(nèi)有被吞噬的鈷鉻鉬顆粒影像（圖9）。

    2.  5    培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞透射電鏡觀察

    當(dāng)金屬顆粒接近J774A.  1巨噬細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞伸出偽足逐漸將較小的顆粒吞噬入細(xì)胞內(nèi)。此時(shí)細(xì)胞開始張大，胞漿內(nèi)線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，表示分泌活動(dòng)活躍，顆粒進(jìn)入細(xì)胞成為吞噬體。胞漿密度變得不均勻，有空泡樣變（圖10）。

    3    討    論

    為闡明假體松動(dòng)的機(jī)理和對(duì)新型假體材料的生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)，眾多學(xué)者采用體外細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、體內(nèi)植入等方法對(duì)顆粒引發(fā)的生物學(xué)反應(yīng)進(jìn)行研究［5～7］。由于體內(nèi)顆粒來源有限，國內(nèi)學(xué)者常采用簡單的材料對(duì)磨、過篩或接受國外贈(zèng)送的方法體外獲得顆粒，而國外學(xué)者采用的方法有對(duì)磨（milling）、金屬熔體霧化（aerosolization）、氣化（gas atomization）、激光制粉法等［4］。由于來源雜亂，顆粒的各項(xiàng)特性變異較大，使大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)因無法重復(fù)和比較而失去實(shí)際意義。如何體外產(chǎn)生生物金屬的顆粒并使之能很好地模擬體內(nèi)顆粒是一個(gè)普遍地急需解決的問題。

    大量的研究已經(jīng)顯示：磨損顆粒的物理、化學(xué)性質(zhì)是影響機(jī)體反應(yīng)程度和假體松動(dòng)的關(guān)鍵因素。這些性質(zhì)包括：顆粒數(shù)量、大小、粒度分布、表面積、化學(xué)元素構(gòu)成、表面形態(tài)、可溶性金屬離子釋放、表面電荷等［5］。使體外生成的顆粒大限度地模擬體內(nèi)磨損顆粒是作者設(shè)計(jì)這個(gè)方法時(shí)始終堅(jiān)持的原則。

    3.  1    顆粒的產(chǎn)生方法

    人工關(guān)節(jié)周圍的金屬磨損顆?？梢詠碓从陉P(guān)節(jié)面、柄-骨界面、假體-骨水泥界面、臼杯-骨界面、組合式假體的柄-頭結(jié)合處。從磨損機(jī)理上講屬于表面摩擦磨損，因此借鑒工業(yè)球磨的方法產(chǎn)生顆粒是合理的。作者自行設(shè)計(jì)的球磨罐具有以下特點(diǎn)：(1)采用相同的材料加工球磨罐和磨塊，無焊接工藝和罐口的密封裝置避免了任何其它材料參與摩擦，保證了顆粒的純凈；(2)潤滑液采用PBS+2%小牛血清+5 IU/ml青霉素+5 μg/ml鏈霉素，動(dòng)物血清對(duì)顆粒進(jìn)行預(yù)孵化(preincubation)，經(jīng)蛋白孵化的顆粒的生物學(xué)行為更接近體內(nèi)顆粒。在實(shí)踐中作者發(fā)現(xiàn)，預(yù)孵化過程能在顆粒表面形成蛋白保護(hù)膜，明顯減少顆粒的聚集成團(tuán)現(xiàn)象，有利于顆粒的離心分離和電鏡觀察；(3)本裝置的所有組件按ASTM F86-76標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行清洗，75%酒精浸泡，高溫滅菌，無菌操作過程和含抗生素的潤滑液都保證了顆粒無微生物和內(nèi)毒素污染，這對(duì)于體內(nèi)和體外醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)是非常重要的；(4)低能量緩慢搖晃和潤滑液的加入，使磨塊與罐壁、磨塊與磨塊之間進(jìn)行緩慢的摩擦，產(chǎn)生細(xì)小的顆粒，篩選效率提高。

    3.  2    顆粒的分離方法

    本實(shí)驗(yàn)采用“梯度離心”的方法對(duì)顆粒進(jìn)行篩選。其原理來自于Stokes' 法則：

    R2=9ηh/(2t［ρ-ρ0］ω2n)

    R：顆粒半徑   η：潤滑液黏滯度   h：樣品高度   t：離心時(shí)間ρ：金屬密度  ρ0：潤滑液密度  ω：離心角速度  n：樣品與旋轉(zhuǎn)軸距離

    本實(shí)驗(yàn)中的常規(guī)變量只有ω和t，因此公式簡化為：

    RCo2=4.  5×106/t(min)×ω2( r/min)

    RTi2=9.  0×106/t(min)×ω2( r/min)

    RCo：鈷鉻鉬合金顆粒半徑 RTi：鈦合金顆粒半徑  t：離心時(shí)間 ω：離心角速度

    總之，本實(shí)驗(yàn)方法簡單，設(shè)備要求不高，利于應(yīng)用和推廣。

    3.  3    顆粒的粒度測(cè)定方法

    傳統(tǒng)的顆粒測(cè)定方法是在光鏡或電鏡下對(duì)顆粒進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，工作量大、精確度差。激光粒度儀利用測(cè)定激光束穿透顆?；鞈乙旱纳⑸涔烙?jì)出顆粒的平均體積，如假設(shè)顆粒為標(biāo)準(zhǔn)球體，則可計(jì)算出顆粒直徑。在應(yīng)用中作者認(rèn)為粒度儀用于人工關(guān)節(jié)顆粒分析的優(yōu)勢(shì)在于：測(cè)量速度快、誤差小、可定量分析、操作簡單，非常適合大量樣本的檢測(cè)與對(duì)比研究。激光粒度儀是確定顆粒大小的有效方法，但在應(yīng)用中仍需注意：(1)激光粒度儀是在忽略顆粒形狀差異的基礎(chǔ)上對(duì)顆粒大小的計(jì)算和估計(jì)，所以顆粒形狀對(duì)于結(jié)果有影響。光鏡或電鏡下對(duì)顆粒進(jìn)行直接計(jì)數(shù)的方法可以彌補(bǔ)上述不足，并可以獲得顆粒形態(tài)的直觀資料，兩者可以取長補(bǔ)短；(2)由于金屬顆粒的密度大，在液體中沉降迅速，也給結(jié)果帶來偏差。所以注意分離好的顆?；鞈乙阂M快進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定前再次震蕩混勻，有條件時(shí)可以選取甘油等高黏度懸浮液。

    3.  4    發(fā)展方向展望

    隨著各種新型生物金屬材料的不斷產(chǎn)生和人們對(duì)金屬-金屬和陶瓷-陶瓷人工關(guān)節(jié)假體的重新評(píng)價(jià)，細(xì)小金屬和陶瓷顆粒在假體松動(dòng)中的作用又成為了研究的熱點(diǎn)［2，3］。為適應(yīng)這一研究發(fā)展的需要，作者正在研究能產(chǎn)生更加細(xì)小金屬和陶瓷顆粒（直徑25 nm左右）的方法。

    圖1    鈦鋁釩合金球磨罐和磨塊    圖2 鈷鉻鉬合金球磨罐和磨塊    圖3    鈦鋁釩顆粒平均直徑Dv90∶1.  009，99.  93%的顆粒直徑在0.  3～1.  2  μm之間    圖4    鈷鉻鉬顆粒平均直徑Dv90∶1.  008，99.  93%的顆粒直徑在0.  3～1.  2  μm之間    圖5    體外人工制造的鈦鋁釩合金顆粒掃描電鏡顯示：顆粒呈片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)則形狀，表面有低密度的血清蛋白沉積（2 000×）    圖6    體外制備鈷鉻鉬合金顆粒掃描電鏡，鉻鉬合金顆粒更多為塊狀顆粒，是由于顆粒輕度聚集，顯得體積更大（2 000×）    圖7    體內(nèi)分離與體外制備的鈦鋁釩顆粒掃描電鏡比較    圖7a    R為體內(nèi)分離顆粒    圖7b    為體外制備顆粒。顆粒的形態(tài)均非常近似，表面都有血清蛋白的沉積膜，體內(nèi)分離顆粒大小分布更加不均勻（R 1 000×，L 2 000×）    圖8    作為空白對(duì)照組的J774A.  1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的形態(tài)，細(xì)胞成圓形或橢圓形，細(xì)胞輪廓清晰，胞漿內(nèi)無明顯吞噬小體（200×）     圖9    J774A.  1巨噬細(xì)胞與鈷鉻鉬顆粒共同培養(yǎng)24 h后的形態(tài)改變，細(xì)胞密度減小，細(xì)胞腫脹成圓形，胞核變大，甚至見到細(xì)胞大片壞死，核溶解，細(xì)胞碎裂，胞漿內(nèi)有被吞噬的顆粒影像↑（200×）    圖10    J774A.  1巨噬細(xì)胞內(nèi)的金屬顆粒，胞漿內(nèi)線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，顆粒進(jìn)入細(xì)胞成為吞噬體，↑為金屬顆粒。胞漿密度變得不均勻（3 500×）參考文獻(xiàn)：

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