DEN聯(lián)合NMOR誘導(dǎo)建立具有轉(zhuǎn)移潛能的肝癌模型

【摘要】  目的 探討二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)聯(lián)合N亞硝基嗎啉(Nnitrosomorpholine，NMOR)誘導(dǎo)建立具有轉(zhuǎn)移潛能的SD大鼠肝癌模型以及合適的劑量和周期。方法 5周齡雄性SD大鼠110只，分成4組：DEN+NMOR組(60只)、DEN組(20只)、NMOR組(20只)以及正常對照組(10只)。第1天DEN+NMOR組和DEN組大鼠按100 mg/kg腹腔注射DEN 1次，NMOR組和對照組給予等量的生理鹽水腹腔注射。第2天DEN+NMOR組和NMOR組給予含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×10-4 NMOR的飲水自由飲用，DEN組和對照組飲用滅菌自來水。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行20周。結(jié)果 16周時(shí)DEN+NMOR組、DEN組、NMOR組及正常對照組肝癌發(fā)生率分別為60%(6/10)、20%(1/5)、0(0/5)、0(0/2)；20周時(shí)分別為88%(21/24)、17%(1/6)、14%(1/7)、0(0/2)。DEN+NMOR組16周及20周肝癌肺轉(zhuǎn)移率分別為33%(2/6)和48%(10/21)，其他組未發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。結(jié)論 (1)用DEN啟動(dòng)，NMOR促進(jìn)的方法誘導(dǎo)建立SD大鼠肝癌模型操作簡便、效果確切、成瘤周期短，有一定的肺轉(zhuǎn)移率。(2)按100 mg/kg給予1次DEN腹腔注射，給予含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×10-4 NMOR的飲水連續(xù)20周可能是有效的劑量和周期。

【關(guān)鍵詞】  N亞硝基嗎啉； 肺轉(zhuǎn)移； 肝腫瘤； SD大鼠

    Establishment of me[x]tastatic hepatocellular carcinoma model induced by diethylnitrosamine and Nnitrosomorpholine  XIE Shengxue, XU Geliang, JIA Weidong, WANG Zhihua, LI Jiansheng, MA Jinliang, GE YongSheng. Department of Hepatic Surgery, Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University, Hefei 230001, China

    Corresponding author: XU Geliang, Email: xugelian@mail.hf.ah.cn

    【Abstract】  ob[x]jective  To establish diethylnitrosamine (DEN) and Nnitrosomorpholine (NMOR) induced me[x]tastatic hepatocellular carcinoma (HCC) model in SD rats and investigate proper dose and treatment period. Methods  One hundred and ten 5weekold male SD rats were randomly divided into DEN+NMOR group (n=60), DEN group (n=20), NMOR group (n=20) and control group (n=10). Rats in DEN+NMOR group and DEN group were given a single intraperitoneal injection of DEN at 100 mg/kg, and rats in NMOR group and control group were intraperitoneally injected with normal saline at the same dosage at the first day. From the second day on, groups DEN+NMOR, NMOR were given 1×10-4 NMOR in the drinking water, while DEN group and control group were given sterilized water for 20 weeks. Results  The HCC incidence in groups DEN+NMOR, DEN, NMOR and control group was 60%(6/10), 20%(1/5), 0(0/5), 0(0/2) by the end of the 16th week, and 88%(21/24), 17%(1/6), 14%(1/7), 0(0/2) by the end of the 20th week. Lung me[x]tastasis incidence in group DEN+NMOR by the end of the 16th and 20th week was 33%(2/6), 48%(10/21), respectively. No lung me[x]tastasis was observed in groups DEN, NMOR, and control group. Conclusions  (1) Establishment of hepatocarcinogenesis model induced by DEN and NMOR in SD rat provides an efficient means for rapid induction of lung me[x]tastasis of HCC. (2) A single intraperitoneal injection of DEN as an initiator of hepatocarcinogenesis at a dose of 100 mg/kg and followed by 1×10-4  NMOR in the drinking water for 20 weeks are appropriate.

    【Key words】  Nnitrosomorpholine;  Lung me[x]tastasis;  Liver neoplasm;  SD rat

    誘導(dǎo)性大鼠肝癌模型是肝癌研究中應(yīng)用廣泛的動(dòng)物模型，常用的誘導(dǎo)藥物為二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)。但DEN誘導(dǎo)的肝癌多為Edmondson Ⅰ級和Ⅱ級，轉(zhuǎn)移率很低，與人肝癌易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的情況不甚符合［1］。因此我們探討用DEN聯(lián)合N亞硝基嗎啉(Nnitrosomorpholine,NMOR)誘導(dǎo)建立具有轉(zhuǎn)移潛能的SD大鼠肝癌模型。

    1  材料與方法

    1.1  誘癌劑

    DEN，分子式(C2H5)2NNO；NMOR，分子式C4H8N2O2。均購自Sigma公司。

    1.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    5周齡雄性SD大鼠110只，體質(zhì)量(151.4±17.6)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分成4組：DEN+NMOR組(60只)，DEN組(20只)，NMOR組(20只)，正常對照組(10只)。飼養(yǎng)于該中心SPF環(huán)境下，滅菌飼料和飲用水由該實(shí)驗(yàn)中心提供，穩(wěn)定飼養(yǎng)1周后，開始誘癌處理。

    1.3  誘癌方法

    參照文獻(xiàn)［2］及我們預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，第1天DEN+NMOR組和DEN組按100 mg/kg腹腔注射DEN 1次，NMOR組和對照組給予等量的生理鹽水。第2天DEN+NMOR組和NMOR組給予含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×10-4 NMOR的飲水自由飲用，DEN組和對照組飲用滅菌自來水。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行20周。分別于第4、8、12周取DEN+NMOR組大鼠2～3只、其他組1～2只處死觀察。剩余的大鼠于16周和20周分兩批處死。實(shí)驗(yàn)中死亡的大鼠隨時(shí)解剖觀察。

    1.4  觀察指標(biāo)

    (1)一般情況：觀察動(dòng)物的精神、飲食、活動(dòng)等情況，定期稱體質(zhì)量。(2)組織學(xué)檢查：摘取肝臟、肺用10%甲醛固定24 h后以層厚1 mm大體切片觀察有無腫瘤結(jié)節(jié)或轉(zhuǎn)移灶。無癌灶者，取肝、肺組織；有癌灶者取癌結(jié)節(jié)及距癌灶邊緣0.5 cm的組織。蘇木精伊紅染色鏡檢，肝細(xì)胞癌按Edmondson分級法分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級。

    1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，體質(zhì)量采用±s表示，檢驗(yàn)用方差分析；統(tǒng)計(jì)肝癌發(fā)生率、肺轉(zhuǎn)移率、大鼠病死率采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法。

    2  結(jié)果

    2.1  大鼠一般情況

    誘癌第1周內(nèi)，DEN+NMOR組和DEN組部分動(dòng)物出現(xiàn)活動(dòng)減少、飲食差，有大鼠死亡；第2周為嚴(yán)重；前3周是死亡發(fā)生的高峰期；4周后大鼠情況好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量增加，死亡數(shù)量明顯減少；5～12周時(shí)，各組情況良好，體質(zhì)量增長較快；14周以后DEN+NMOR組大鼠體質(zhì)量增加較其他組減慢；20周3組體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34 499，P<0.01)。DEN+NMOR組、DEN組、NMOR組及對照組大鼠16周病死率分別為28%(17/60)、25%(5/20)、15%(3/20)、0(0/10)，20周病死率分別為30%(18/60)、25%(5/20)、20%(4/20)、0(0/10)，DEN+NMOR、DEN、NMOR 3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.609，P>0.05)。

    2.2  肝癌發(fā)生率及肝臟病理變化

    16周和20周時(shí)各組肝癌發(fā)生率見表1。早期(4～8周)主要病理改變?yōu)楦渭?xì)胞變性、壞死。16周時(shí)，DEN+NMOR組部分肝臟表面可見灰白色結(jié)節(jié)，一般為1～2個(gè)，直徑為0.3～0.5 cm；20周時(shí)，大鼠肝臟多腫大，表面粗糙，質(zhì)地脆弱，呈典型結(jié)節(jié)性肝硬化表現(xiàn)。癌結(jié)節(jié)增大、增多，散在、多發(fā)，直徑為0.5～2.0 cm。鏡下肝臟呈結(jié)節(jié)性肝硬化、肝癌表現(xiàn)。癌細(xì)胞多排列實(shí)片狀及腺樣，可見靜脈癌栓(圖1)。在DEN+NMOR組27只成癌動(dòng)物中，25只為肝細(xì)胞癌，2只為混合性肝癌。腫瘤分化以中、低分化為主，其中Ⅰ級4只，Ⅱ級9只，Ⅲ級12只。表1  肝癌發(fā)生率及肺轉(zhuǎn)移率

    2.3  肺轉(zhuǎn)移

    DEN+NMOR組發(fā)生肝癌的大鼠中，肺轉(zhuǎn)移率在16周和20周時(shí)分別為33%(2/6)、48%(10/21)(表1)。肺表面出現(xiàn)灰白色結(jié)節(jié)，部分有融合。病理檢查為肝癌肺轉(zhuǎn)移并可見血管內(nèi)癌栓(圖2)。

    3  討論

    誘發(fā)性肝癌模型的建立多采用氨基偶氮染料、芳香胺類化合物、亞硝胺及黃曲霉素等化學(xué)藥物，其中以亞硝胺類，尤其是DEN是可靠的誘癌藥物。NMOR屬于亞硝胺類，用DEN+NMOR誘導(dǎo)建立F344大鼠肝癌模型，發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)生率和肝癌肺轉(zhuǎn)移率均較高，而且如果劑量合適，可以明顯減少大鼠的病死率［2］。國內(nèi)普遍使用的是SD或Wistar等封閉群大鼠。本實(shí)驗(yàn)提示，用DEN+NMOR聯(lián)合誘導(dǎo)建立具有轉(zhuǎn)移潛能的SD大鼠肝癌模型是可行的。雖然Yoshino等［2］使用DEN 100 mg/kg，然后給予含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4×10-5 NMOR飲水建立F344大鼠肝癌模型，20周時(shí)肝癌發(fā)生率達(dá)到。但我們預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)在SD大鼠上使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4×10-5 NMOR卻只得到很低的誘癌成功率，原因可能是SD大鼠對腫瘤的易感性低于F344大鼠。改用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×10-4 NMOR后，效果較好。是否還可以加大劑量或延長實(shí)驗(yàn)周期來獲得更好的效果，尚需進(jìn)一步研究。

    大鼠死亡時(shí)間分布多在實(shí)驗(yàn)開始4周內(nèi)，死亡的原因主要有肺部感染、急性肝損害、腸壞死等。

    前4周主要是變性，8周后可看到增生反應(yīng)，出現(xiàn)嗜酸性、嗜堿性結(jié)節(jié)，而這些現(xiàn)象被認(rèn)為是肝癌發(fā)生過程中的幾種關(guān)鍵變化［3-5］。16周時(shí)出現(xiàn)肉眼可見的癌結(jié)節(jié)，20周時(shí)肝臟呈現(xiàn)典型的結(jié)節(jié)性肝硬化，癌結(jié)節(jié)散在、多發(fā)。近一半的肝癌大鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。此過程與我國人肝癌多經(jīng)歷肝炎→肝硬化→肝癌發(fā)生、發(fā)展→侵襲轉(zhuǎn)移的病理過程相類似。DEN+NMOR組肝癌發(fā)生率高于單用DEN或NMOR組，分級多為Ⅱ、Ⅲ級，有靜脈癌栓和肺轉(zhuǎn)移灶。這說明DEN+NMOR誘發(fā)肝癌效果肯定，癌分化程度較低，有一定的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力。

    本實(shí)驗(yàn)表明，用DEN+NMOR聯(lián)合誘導(dǎo)建立SD大鼠肝癌模型，操作簡便、成瘤周期較短，有一定的肺轉(zhuǎn)移率；病理過程遵循損傷、增生、硬化和肝癌發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的規(guī)律，可為研究肝癌的機(jī)制以及干預(yù)治療提供平臺。

【參考文獻(xiàn)】
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［2］ Yoshino H, Futakuchi M, Cho YM, et al. Modification of an in vivo lung me[x]tastasis model of hepatocellular carcinoma by low dose Nnitrosomorpholine and diethylnitrosamine. Clin Exp me[x]tastasis,2005,22(5):441-447.

［3］ 趙魯笳,劉小北,郭宏偉.3′MeDAB誘發(fā)大鼠肝癌模型的建立與病理研究.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2004,8(3):243-245.

［4］ 姜幼純,董奇男,肖邦良,等.非壞死劑量二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌模型的研究.華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2001,32(4):555-558，628.

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作者：謝勝學(xué) 許戈良 莢衛(wèi)東 王志華 李建生 馬金良 葛勇勝

作者單位：230001 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院肝臟外科(謝勝學(xué)、許戈良、莢衛(wèi)東、李建生、馬金良、葛勇勝)，病理科(王志華)