膽管癌細(xì)胞層黏連素受體過(guò)表達(dá)上調(diào)Fas配體的研究

【摘要】  目的 探討膽管癌細(xì)胞層黏連素受體(laminin receptor,LNR)過(guò)表達(dá)與Fas配體(Fas ligand,FasL)作用的關(guān)系。方法 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染順義、反義LNR寡核苷酸至膽管癌細(xì)胞QBC939中，用RTPCR和細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)兩組細(xì)胞FasL及LNR的表達(dá)情況。結(jié)果 轉(zhuǎn)染反義組LNR和FasL基因表達(dá)均較轉(zhuǎn)染順義組明顯降低(t=14.136,25.161,P<0.01)。結(jié)論 LNR過(guò)表達(dá)在膽管癌免疫逃逸中的作用可能是通過(guò)FasFasL信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】  膽管腫瘤； 層黏連素受體； Fas配體

     Overex[x]pression of laminin receptor in upregulating Fas ligand in cells of cholangiocarcinoma  GAO Zhanfeng, LI Tianyu, GAO Yinghong, JIANG Weiwei, WU Hongye, WANG Shuguang. Institute of Hepatobiliary Surgery & Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

    Corresponding author: WANG Shuguang, Email: sgwang90@yahoo.com.cn

    【Abstract】  ob[x]jective  To explore the relationship between overex[x]pression of laminin receptor(LNR) and Fas ligand (FasL) in cells of cholangiocarcinoma. Methods  Sense and antisense oligonucleotides of LNR were transfected into the cholangiocarcinoma cell line QBC939 by the method of liposome transfection. The ex[x]pressions of FasL and LNR were detected by RTPCR and immunohistochemistry. Results  Compared with sense oligonucleotide of LNR, the ex[x]pression of LNR and FasL in antisense oligonucleotide of LNR was significantly downregulated (t=14.136, 25.161, P<0.01).Conclusions  The effect of overex[x]pression of LNR on immune evasion of cholangiocarcinoma is realized via the Fas/FasL pathway.

    【Key words】  Cholangiocarcinoma;  Laminin receptor;  Fas ligand

    層黏連素(laminin，LN)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM) 的主要成分。腫瘤細(xì)胞膜上含有其配體即層黏連素受體(laminin receptor，LNR)，兩者結(jié)合可誘導(dǎo)分泌包括IV型膠原酶在內(nèi)的蛋白水解酶, 后者有助于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。我們前期研究發(fā)現(xiàn)LNR過(guò)表達(dá)與臨床膽管癌惡性表型關(guān)系密切［1-4］。本研究將探討LNR在膽管癌免疫逃逸機(jī)制中與Fas配體(Fas ligand,FasL)作用的關(guān)系。

    1  材料與方法

    1.1  試劑

    RPMI 1640培養(yǎng)液、胰酶和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；鼠抗人層黏連蛋白受體單克隆抗FastTM Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒和SV Total RNA Isolation System試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自杭州博日科技公司；PCR試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司。

    1.2  細(xì)胞培養(yǎng)

    人肝外膽管癌細(xì)胞株QBC939是一株來(lái)源于人肝門(mén)部膽管癌的右肝轉(zhuǎn)移灶，為低分化腺癌，由本研究所王曙光建株保存［5］。在37 ℃，5% CO2條件下，含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 mg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和傳代。

    1.3  設(shè)計(jì)合成LNR順義、反義寡核苷酸

    按反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)要求，針對(duì)LNR mRNA序列(Gene Bank：NM 002295)核心區(qū)的AUG上、下游序列，設(shè)計(jì)18聚同源和互補(bǔ)的寡核苷酸［6］。所設(shè)計(jì)的序列如下：LNR反義寡核苷酸序列(18mer)：5’GGCTCCGGACATTGTGAA3’；LNR順義寡核苷酸序列(18mer)：5’TTCACAATGTCCGGAGCC3’。LNR順義、反義寡核苷酸(全硫代修飾)+綠色熒光標(biāo)記由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    1.4  順義組、反義組LNR細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期QBC939細(xì)胞5×105個(gè)/ml，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體操作方法同參考文獻(xiàn)［7］。轉(zhuǎn)染劑量為L(zhǎng)NR順義組、反義組寡核苷酸各3 μg，按DNA∶脂質(zhì)體=1∶2進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h行細(xì)胞免疫組織化學(xué)和提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RTPCR，檢測(cè)LNR和FasL蛋白的mRNA表達(dá)。

    1.5  圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用Quantity one凝膠定量分析軟件對(duì)RTPCR凝膠條帶進(jìn)行分析，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2  結(jié)果

    2.1  順義組、反義組LNR細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    順義組和反義組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到95%以上(圖1，2)。

    2.2  順義組、反義組LNR細(xì)胞免疫組織化學(xué)

    LNR和FasL陽(yáng)性反應(yīng)物成棕黃色顆粒，主要位于細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi)。轉(zhuǎn)染反義組LNR陽(yáng)性表達(dá)較轉(zhuǎn)染順義組明顯降低，說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)染反義的LNR寡核苷酸可以沉默LNR基因表達(dá)(圖3，4)。同樣，轉(zhuǎn)染反義組FasL陽(yáng)性表達(dá)較轉(zhuǎn)染順義組明顯降低(圖5，6)。

    2.3  順義組、反義組LNR QBC939細(xì)胞RTPCR

    LNR和FasL mRNA RTPCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。用Quantity one凝膠定量分析軟件對(duì)RTPCR凝膠條帶進(jìn)行灰度掃描分析(圖8)。轉(zhuǎn)染反義組LNR和FasL基因表達(dá)均較轉(zhuǎn)染順義組明顯降低(t=14.136,25.161,P<0.01)。

    3  討論

    在大多數(shù)情況下，腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和攻擊，進(jìn)而在體內(nèi)不受限制地生長(zhǎng)和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其中，腫瘤細(xì)胞上調(diào)FasL的表達(dá)就是其中的機(jī)制之一。

    FasL是相對(duì)分子質(zhì)量為40×103的Ⅱ型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子超家族成員，通過(guò)與細(xì)胞膜受體Fas結(jié)合激活Fas介導(dǎo)的死亡信號(hào)復(fù)合體，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。很多惡性腫瘤細(xì)胞包括結(jié)腸癌、胃癌、肺癌及腦膠質(zhì)瘤等自身存在FasL過(guò)表達(dá)。高表達(dá)FasL可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)和NK細(xì)胞凋亡，抑制CTLs和NK細(xì)胞由Fas介導(dǎo)的殺傷腫瘤細(xì)胞作用，產(chǎn)生所謂腫瘤細(xì)胞的“反擊”現(xiàn)象［8-9］。而且，在轉(zhuǎn)移性腫瘤中，如在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶中，F(xiàn)asL的表達(dá)明顯高于原發(fā)灶腫瘤，并通過(guò)FasFasL途徑誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡，從而抑制機(jī)體的全身免疫。這說(shuō)明FasL的表達(dá)有利于腫瘤細(xì)胞形成新的轉(zhuǎn)移灶。

    近年研究已證明，幾乎所有惡性實(shí)體腫瘤細(xì)胞LNR，特別是相對(duì)分子質(zhì)量為67×103的LNR表達(dá)上調(diào)，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［10-11］。我們前期對(duì)LNR表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)膽管癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)：LNR過(guò)表達(dá)與臨床膽管癌惡性表型關(guān)系密切，主要通過(guò)：(1)介導(dǎo)膽管癌細(xì)胞與ECM間黏附，激活局部黏附激酶而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移；(2)通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)和在胞質(zhì)內(nèi)的重排而增強(qiáng)癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力；(3)介導(dǎo)蛋白水解酶MMP2、MMP9、uPA的mRNA和蛋白表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)ECM的降解；(4)通過(guò)激活FAK激酶MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而調(diào)節(jié)膽管癌細(xì)胞侵襲過(guò)程。其次，我們還發(fā)現(xiàn)：當(dāng)LNR反義寡核苷酸抑制高轉(zhuǎn)移性膽管癌細(xì)胞的LNR過(guò)表達(dá)，則明顯抑制膽管癌細(xì)胞的侵襲能力。李子禹等［12］已經(jīng)在膽管癌細(xì)胞株QBC939中證明FasL高表達(dá)。

    上述研究提示LNR過(guò)表達(dá)與膽管癌細(xì)胞FasL表達(dá)上調(diào)可能存在內(nèi)在聯(lián)系。因此，本研究基于前期研究工作基礎(chǔ)，通過(guò)轉(zhuǎn)染反義LNR寡核苷酸沉默LNR基因的表達(dá)，研究LNR是否在膽管癌免疫逃逸中通過(guò)FasL來(lái)實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)細(xì)胞免疫組織化學(xué)和RTPCR方法均提示在膽管癌中LNR過(guò)表達(dá)時(shí)FasL的表達(dá)異常增高，當(dāng)將LNR基因沉默后，F(xiàn)asL基因的表達(dá)同時(shí)也降低。這說(shuō)明LNR基因表達(dá)降低時(shí)可導(dǎo)致FasL基因表達(dá)相應(yīng)降低。我們初步認(rèn)為L(zhǎng)NR過(guò)表達(dá)在膽管癌免疫逃逸中的作用可能是通過(guò)FasFasL信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。LNR過(guò)表達(dá)可能激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路MAPK而調(diào)控FasL的基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)CTLs凋亡，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。至于LNR過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞金屬蛋白酶是否促進(jìn)細(xì)胞膜表面結(jié)合的FasL降解，形成可溶性FasL，干擾機(jī)體的免疫識(shí)別和攻擊能力，以及LNR過(guò)表達(dá)具體與FasL啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)哪些基因表達(dá)有關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。

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作者：高占峰 李天宇 高應(yīng)鴻 蔣衛(wèi)偉 吳虹曄 王曙光

作者單位：400038 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍肝膽外科研究所、中國(guó)人民解放軍西南肝膽外科醫(yī)院