IGFBP3、caspase3在小鼠白念珠菌陰道炎模型黏膜組織中的表達

　作者：陳嶸,樊翌明,林映萍,黎兆軍,吳志華　　作者單位：廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，廣東湛江 524001

　　【摘要】 目的 研究胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)在ICR小鼠白念珠菌陰道炎模型中陰道黏膜局部的表達及其臨床意義。方法 構(gòu)建ICR小鼠白念珠菌陰道炎模型，運用熒光實時定量PCR及免疫組化檢測感染組與正常組中IGFBP3、caspase3表達的差異。結(jié)果 構(gòu)建ICR小鼠白念珠菌陰道炎模型成功，感染組陰道組織中見大量念珠菌絲及炎癥細胞浸潤;IGFBP3、caspase3在感染組中較正常組高表達(P<0.01)且兩者表達呈正相關(guān)(rs=0.683，P<0.01)。結(jié)論 IGFBP3、caspase3在感染組中高表達可能與念珠菌下調(diào)陰道黏膜免疫并致病有關(guān)。
　　【關(guān)鍵詞】 caspase3;IGFBP3;白念珠菌;動物模型

　　ex[x]pression of IGFBP3 and caspase3 in murine vaginal mucosa with experimental candidiasis　CHEN Ronɡyi，F(xiàn)ɑn Yiminɡ，LIN Yinɡpinɡ，LI Zhɑojun，WU Zhihuɑ　(Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)

　　Abstract:ob[x]jective To investigate the ex[x]pression of insulinlike growth factorbinding protein3 (IGFBP3) and caspase3 in murine vaginal mucosa with experimental candidiasis.Methods The ICR murine vaginal mucosa was infected with Candida albicans to establish candidiasis model. The level of IGFBP3 and caspase3 in murine vaginal mucosa from the candidiasis group and the normal control group were determined by realtime quantitative fluorescent PCR and immunohistochemistry, respectively.Results In the candidiasis group, the vaginal mucosa was seen with a great deal of monilia mycelia and inflammatory cells. The ex[x]pression of IGFBP3 and caspase3 were higher in the candidiasis group than those in the control group (P<0.01), with a positive correlations between the ex[x]pression of IGFBP3 and caspase3 (rs=0.683,P<0.01).Conclusion The candidiasis model is successfully constructed. The overex[x]pression of IGFBP3 and caspase3 in the experimental candidiasis may play a role in the pathogenesis of candidal vaginitis through reducing the immunity of the vaginal mucosa.

　　Key words：caspase3;IGFBP3;Candida albicans;murine model

　　念珠菌性陰道炎(monilial vaginitis) 絕大部分感染由白念珠菌引起，是一種常見的陰道黏膜真菌感染性疾病。表現(xiàn)為外陰瘙癢和陰道分泌物增多、陰道疼痛、灼熱，可通過性接觸傳染。約75%育齡婦女在一生中至少發(fā)生一次念珠菌性陰道炎，其中約半數(shù)病例有再次發(fā)作，5%病例發(fā)展為復(fù)發(fā)性念珠菌性陰道炎[1] 。此病的免疫學(xué)發(fā)病機制尚未闡明，近研究發(fā)現(xiàn):外周血中產(chǎn)生的細胞免疫可能并不是小鼠陰道黏膜主要的防御機制,而更多的是通過局部細胞免疫發(fā)揮機體的防御機制，因此黏膜免疫已成為該病研究熱點[2]。有研究表明胰島素生長因子(IGFⅠ)不僅在機體生長發(fā)育中充當(dāng)重要角色，而且可激活體內(nèi)淋巴細胞、NK細胞、巨噬細胞對免疫調(diào)節(jié)及抑制凋亡起重要作用。胰島素生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)是一種新發(fā)現(xiàn)的分泌蛋白，它在組織中廣泛存在，并可結(jié)合IGFⅠ進而對免疫起調(diào)控作用[3]。但IGFBP3、caspase3及其IGFIGFBP軸在念珠菌陰道炎中的表達及分子調(diào)控途徑尚未清楚。因此，有必要對上述細胞因子在小鼠白念珠菌陰道炎模型中陰道黏膜免疫的作用進行深入研究，進而闡明念珠菌性陰道炎的發(fā)病機制，為本病的有效防治提供理論依據(jù)。
　　1 材料和方法
　　1.1 念珠菌的培養(yǎng)及實驗動物
　　菌株為標(biāo)準(zhǔn)白念珠菌(No. 00270)株，實驗動物為健康清潔級雌性ICR 小鼠30只，飼料為標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料(均由廣東學(xué)院實驗動物中心提供)。鼠齡9～11 周,體質(zhì)量(26 ±4)g，隨機分為感染組(A組,15只)及正常對照組(B組,15只)，飼養(yǎng)于清潔級實驗動物環(huán)境。培養(yǎng)基為改良沙堡瓊脂培養(yǎng)基平皿。真菌懸液的制備: 參照文獻[4],將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于含1 %蛋白胨和0.1 %葡萄糖的液基中,25℃水浴振蕩培養(yǎng)16～18 h (見圖1a)。顯微鏡下計數(shù)，使菌懸液密度為5×106個孢子/mL 。
　　1.2 ICR小鼠白念珠陰道炎模型的建立
　　A組為雌激素化組，每只ICR小鼠在接種前6d開始后腿皮下注射含有0.1 mg 苯甲酸雌二醇油劑0.1mL ,每2d注射1次。B組于相同部位注射植物油0.1mL,次數(shù)同A組。將真菌懸液10μL(即白念珠菌孢子接種量為5 ×104個) 在接種日注入A組小鼠的陰道內(nèi),每只小鼠接種后倒置5min，B組用生理鹽水代替。接種后的第2、4、7、14 天為檢測日,每個檢測日在A組選取5只,B組選取5只小鼠，麻醉后，用生理鹽水濕潤的陰道拭子在A、B組小鼠陰道組織分別取陰道分泌物涂片，并實施手術(shù)將各小鼠陰道組織取下，分兩份[4]。一份石蠟包埋待HE染色、PAS染色及免疫組化檢測，另一份提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再進行熒光定量PCR檢測。
　　1.3 免疫組化檢測
　　石蠟標(biāo)本4μL切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，滅活過氧化物酶，抗原水浴修復(fù)后。嚴(yán)格按Caspase3(1:20 R&D systems U.S.A MAB835)及免疫組化AEC染色試劑盒(R&D systems U.S.A CTS018)說明書進行，設(shè)陽性對照及空白對照。結(jié)果判斷:以胞漿染色(或)胞核著色為陽性，并按著色強弱分級：無著色為0，淺棕紅色為1，深棕紅為2。著色范圍以計數(shù)陽性細胞所占的百分比均值：<5%為0，5%～25%為1，26%～50%為2，51～75%為3，>75%為4。上述兩項相加為Caspase3表達強度積分：1為陰性，2為弱陽性(+)，3、4為陽性()，>4為強陽性()[5]。采用OLYMPUS的BX51顯微系統(tǒng)及DP71圖像采集系統(tǒng)進行觀測結(jié)果并拍照。
　　1.4 實時熒光定量PCR檢測
　　用Trizol溶液((Invitrogen, San Diego, CA, U.S.A.)提取小鼠陰道組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行實時熒光定量PCR檢測。根據(jù)GeneBank序列設(shè)計IGFBP3、βactin引物，序列見表1。熒光PCR儀為(MX 3000P 美國stratagene),反應(yīng)條件同文獻。應(yīng)用SYBR GreenⅠ熒光染料(美國Biotium公司)技術(shù)行實時定量PCR反應(yīng)，獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算機分析Ct值。
　　1.5 統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理,數(shù)據(jù)以(±s)表示,用MannWhitney秩和檢驗及Spearman相關(guān)分析進行統(tǒng)計描述和多樣本均數(shù)組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　表1 引物序列(略)

　　注：F,上游;R，下游。
　　2 結(jié)果

　　2.1 ICR小鼠念珠菌模型構(gòu)建結(jié)果
　　A組小鼠真菌接種2 d后陰道出現(xiàn)白色分泌物，第4、7天分泌物增多，并出現(xiàn)外陰紅腫，14 d后小鼠陰道口紅腫明顯，出現(xiàn)黃白色豆渣樣分泌物。而B組小鼠無明顯陰道分泌物及外陰紅腫。A組用無菌陰道拭子取陰道分泌物涂片，見芽生孢子及菌絲，第4、7天菌絲密集并成團，可見較多淋巴細胞、多形核巨噬細胞、上皮細胞等，B組無孢子及菌絲，可見少量上皮細胞。上述結(jié)果表明成功構(gòu)建小鼠念珠菌模型。
　　2.2 PAS染色及免疫組化結(jié)果
　　陰道石蠟包埋標(biāo)本切片用PAS染色后可見A組陰道黏膜組織或其外有菌絲附著，侵入以第7天為明顯，后逐漸減少，并持續(xù)到觀察期末。陰道黏膜及其下可見炎性浸潤細胞(見圖1a)紅色箭頭為念珠菌菌絲。B組無菌絲及明顯炎性細胞浸潤(見圖1b)。小鼠陰道組織免疫組化caspase3檢測發(fā)現(xiàn)A組caspase3表達明顯高于B組(Z=3.904,P<0.001)，AEC顯色示caspase3陽性呈棕紅色主要位于上皮細胞及炎性細胞胞漿，但部分細胞可出現(xiàn)胞漿、胞核染色，B組無明顯caspase3陽性細胞(見圖1c、d)。
　　2.3 熒光PCR結(jié)果

　　應(yīng)用RTPCR法，以βactin為內(nèi)參，分別對A組和B組在小鼠念珠菌陰道炎模型第7天陰道組織提取的IGFBP3mRNA進行定量檢測，獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算機分析ΔCt值。SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)描述。結(jié)果顯示A組在白念珠菌感染后IGFBP3mRNA的含量均升高;B組變化不明顯(見圖2)。A組Ct值(15.937±4.740)，B組Ct值(9.426±1.537)，但方差不齊，采用秩和檢驗(Z=4.726，P<0.001)兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，A組IGFBP3mRNA表達量高于B組，見圖2。采用Spearman相關(guān)分析示IGFBP3表達與caspase3表達呈正相關(guān)性，rs=0.683。
　　(a)A組小鼠第7天陰道組織切片，紅色箭頭所示為PAS陽性的念珠菌菌絲，(PAS染色 ×200);(b)B組小鼠陰道組織切片無PAS陽性的念珠菌菌絲(PAS染色 ×200);(c)A組陰道組織第7天免疫組化caspase3檢測，caspase3陽性呈棕紅色主要位于上皮細胞及炎性細胞胞漿，呈強陽性(AEC染色 ×200)紅色箭頭為陽性表達細胞;(d)B組第7天免疫組化caspase3檢測,無明顯caspase3陽性細胞(AEC染色 ×200)。
　　圖1 A、B兩組陰道組織切片及免疫組化caspase-3檢測(略)

　　RealtimePCR示A組IGFBP3mRNA在白念珠菌感染7 d后，其表達量明顯高于B組。
　　圖2 A、B兩組IGFBP-3mRNA表達量(略)

　　3 討論

　　IGFBP3是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白超家族( IGFBPs) 中一名新成員。用小鼠IGFBP3的cDNA作探針,從人的肝細胞cDNA文庫中篩選到人的IGFBP3的cDNA序列，全長1920bp，基因定位于11A1[6]。IGFBP3與其他結(jié)合蛋白有高度同源性,它能與胰島素樣生長因子(IGFs) 相結(jié)合，攜帶、轉(zhuǎn)運IGF，延長IGF的半衰期，調(diào)控IGF的生物活性;更為重要的是，IGFBP3具有許多不依賴于IGF的生物作用。IGFBP3在多種組織細胞的生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、凋亡、癌變及黏膜組織炎癥等病理生理過程中起重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)在許多單核細胞、淋巴細胞、NK細胞表面存在IGFI受體，表明IGFI可對免疫起調(diào)節(jié)作用，如IGFI可作為IL7的輔助因子促進B細胞增殖，Th1型細胞因子如IFNγ、TNFα增強IGFⅠ的表達，并激活T細胞免疫功能?？乖碳ひ嗫墒笽GFI上調(diào)，從而引起機體的特異性免疫[78]。上述研究提示IGFI可增強免疫防御功能，而IGFBP3可與IGFI高親和力結(jié)合從而起免疫抑制作用。陰道黏膜含有大量上皮細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和T細胞，上述細胞是陰道的黏膜免疫重要組成成份，而在念珠菌性陰道炎的發(fā)病與黏膜免疫的抑制及陰道微環(huán)境改變有關(guān)。但IGFBP3在黏膜免疫中的作用及念珠菌性陰道炎的致病機制尚未明確，因此本課題構(gòu)建了小鼠念珠菌性陰道炎感染模型，對上述問題進行探討。
　　根據(jù)陰道涂片及陰道組織PAS染色，我們發(fā)現(xiàn)A組(感染組)小鼠陰道分泌物涂片可見大量芽生孢子菌絲，陰道上皮細胞及淋巴細胞、多形核細胞，陰道組織見念珠菌菌絲侵入。B組未發(fā)現(xiàn)芽生孢子及菌絲，表明小鼠念珠菌性陰道炎感染模型構(gòu)建成功。熒光PCR結(jié)果A組IGFBP3mRNA的表達明顯較B組升高(P<0.01), 提示IGFBP3表達上調(diào)可能與念珠菌性陰道炎的發(fā)病有密切關(guān)系。IGFBP3在腫瘤中主要起促凋亡作用，是機體抵抗腫瘤的自身保護因素。那么IGFBP3在念珠菌性陰道炎中上調(diào)在其發(fā)病中的意義何在呢?于是我們采用免疫組化檢測A、B兩組間促凋亡關(guān)鍵蛋白caspase3表達的差異。本研究發(fā)現(xiàn)caspase3在感染組(A組)中高表達，陽性表達主要位于上皮細胞及炎性細胞胞漿(見圖1c、d)，而caspase3的表達與IGFBP3呈正相關(guān)(rs=0.683，P<0.01)。因此我們認為IGFBP3在念珠菌感染時表達上調(diào)可引起上皮細胞及樹突狀細胞、巨噬細胞和T細胞等陰道的黏膜免疫重要組成成份細胞凋亡，黏膜免疫抑制導(dǎo)致了念珠菌性陰道炎的發(fā)病。蔣洪敏等[9]研究指出白念珠菌菌血癥能誘導(dǎo)小鼠胸腺細胞凋亡，而且呈時間和劑量依賴性而白念菌誘導(dǎo)小鼠胸腺細胞凋亡有賴于真菌的代謝，熱滅活的白念珠菌不能誘導(dǎo)胸腺細胞凋亡。上述證據(jù)支持了念珠菌感染可誘導(dǎo)免疫細胞凋亡，但念珠菌代謝抗原如何引起IGFBP3的表達上調(diào)進而導(dǎo)致T免疫細胞凋亡還需進一步研究。而IGFBP3的促凋亡作用有研究表明是通過非IGF結(jié)合途徑引起，如促進SMARCB1合成導(dǎo)致BNIP3L(BCL2家族的促凋亡蛋白)升高引起caspase3激活所致[10]。另外IGFBP3與IGFⅠ結(jié)合抑制其免疫增強功能也參與了念珠菌性陰道炎的發(fā)病。其次近的研究表明，IGFBP3除了與IGF結(jié)合外，還是一種重要的胰島素結(jié)合因子，它與胰島素以高親和力相結(jié)合(是IGFBP3與IGF結(jié)合力的500倍)，從而阻斷胰島素與其受體間的結(jié)合，阻止后者自身磷酸化及其它后續(xù)反應(yīng)的發(fā)生，從而參與糖代謝功能的紊亂和II型糖尿病的發(fā)生，而糖尿病是念珠菌感染的易發(fā)因素，因而IGFBP3高表達亦可能是促進念珠菌感染的間接因素之一。
　　總之，IGFBP3在念珠菌性陰道炎中高表達，其可能通過促進黏膜免疫相關(guān)細胞的凋亡，使T細胞減少，宿主免疫由Th1 型轉(zhuǎn)化為Th2 型[4];以及增加念珠菌易感性等因素來參與念珠菌性陰道炎的發(fā)病，但具體致病機制還需進一步深入研究。
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