二苯乙烯苷對(duì)糖尿病大鼠腎臟沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源體和 TGFβ1蛋白的影響

作者：李彩蓉,蔡飛1,趙辛元,李佳,賈延龍　　作者單位：1 咸寧學(xué)院藥學(xué)院(咸寧學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

　　【摘要】目的探討二苯乙烯苷(TSG)對(duì)糖尿病大鼠腎臟沉默信息調(diào)節(jié)因子2(SIRT1)和 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)蛋白的影響。方法 以鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病大鼠模型和高糖刺激大鼠腎系膜細(xì)胞株為研究對(duì)象，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定生化指標(biāo)，比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的活性、丙二醛(MDA)含量的變化，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)測(cè)定腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)增殖活性，Western印跡檢測(cè)大鼠腎臟和系膜細(xì)胞中SIRT1和 TGFβ1蛋白表達(dá)。結(jié)果 糖尿病腎病(DN)組大鼠的24 h尿蛋白定量、腎臟肥大指數(shù)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)與對(duì)照組比較明顯增加(P<0.01)，而TSG能明顯改善上述指標(biāo)，并改善大鼠抗氧化應(yīng)激能力。TSG能明顯增加糖尿病大鼠腎臟和高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)，并抑制TGFβ1蛋白表達(dá)。結(jié)論 TSG對(duì)DN具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能通過提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力，調(diào)節(jié)SIRT1活性，并抑制腎臟TGFβ1蛋白表達(dá)而減少DN損害。
　　【關(guān)鍵詞】 糖尿病;系膜細(xì)胞;二苯乙烯苷;沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源體;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

　　【Abstract】 ob[x]jective To observe the influence of tetrahydroxystilbene glucoside (TSG)on silent mating type information regulation 2 homolog 1 (SIRT1) and transforming growth factorβ1 (TGFβ1) in kidney of rat with diabetes. Methods Diabetes mellitus model was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin (60 g/kg). The serum biochemical parameters in rats were measured by automatic chemistry analyzer. The activity of superoxide dismutase (SOD) and the levels of malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) in renal tissue were assayed. The proliferation activity of mesangial cells was assessed by MTT assay, the ex[x]pression of SIRT1 and TGFβ1 protein examined by Western blot. Results 24 hours urinary albumin excretion (UAE), kidney hypertrophy index, cholesterol (TC), triacylglyceride (TG), serum urea nitrogen (BUN), serum creatinine in diabetic rats were increased compared with control group. TSG could improve above changes and the ability of antioxidation. TSG could increase the ex[x]pression of SIRT1 in kidney of diabetic rat and mesangial cells cultured in high glucose and inhibit the ex[x]pression of TGFβ1. Conclusions The protective mechanisms of TSG against DN are involved in the alleviation of oxidative stress injury and the depression of TGFβ1, partially via the activation of SIRT1.

　　【Key words】 Diabetes; Mesangial cell; Tetrahydroxystilbene glucoside; Silent mating type information regulation 2 homolog 1; Transforming growth factorβ1

　　糖尿病腎病(DN)的發(fā)病機(jī)制與高血糖作為啟動(dòng)因子而誘導(dǎo)產(chǎn)生的多種血管活性物質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞介質(zhì)以及腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變等因素的綜合作用有關(guān)〔1〕。上述因素均可引起腎臟細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生改變，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β1蛋白的激活在DN的發(fā)生發(fā)展中起核心作用〔2〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源體(SIRT1)是防治糖尿病及相關(guān)性疾病的重要靶點(diǎn)之一，激活SIRT1對(duì)2型糖尿病有防治作用， 并認(rèn)為SIRT1的小分子激活劑可用于防治DN〔3，4〕。二苯乙烯苷(TSG)是傳統(tǒng)中藥蓼科植物何首烏中提取的一種水溶性有效成分，具有抗炎、抗衰老、降血脂、心血管活性和免疫調(diào)節(jié)等功能〔5〕。本實(shí)驗(yàn)采用糖尿病大鼠模型和高糖環(huán)境下培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)，觀察TSG干預(yù)后對(duì)糖尿病大鼠SIRT1和 TGFβ1蛋白影響，初步探索TSG對(duì)DN的保護(hù)作用機(jī)制。
　　1 材料與方法
　　1.1 主要試劑和儀器
　　大鼠腎系膜細(xì)胞株HBZY1(中國典型動(dòng)物保藏中心)，TSG(北京中國藥品生物制品鑒定所，純度98%，批號(hào)Z0809123)，鏈脲佐菌素(STZ;Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)液(Gibco，USA)，新生胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)，胰蛋白酶(Sigma,USA)，N2羥基乙烷基哌嗪N2乙烷磺酸(HEPES，Sigma，USA)，超氧化化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)試劑盒(南京建成);SIRT1、TGFβ、βactin抗體(Santa Cruz，USA)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma);血糖測(cè)定儀(美國，羅氏);酶標(biāo)儀(BIOTEK FL800美國產(chǎn)品);細(xì)胞分析儀/CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(德國CASY公司產(chǎn)品);Spectrafluor Plus光度儀(TECAN公司)。
　　1.2 動(dòng)物模型建立和分組
　　大鼠糖尿病模型的建立和分組：清潔級(jí)近交系雄性SD大鼠(由湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重(220±14) g，每籠5只，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，12 h光照周期。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，單次腹腔注射用檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L;pH4.5)新鮮配制STZ 60 mg/kg。3 d后空腹血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病，成模后，將大鼠隨機(jī)分成DN模型組、TSG干預(yù)組Ⅰ和Ⅱ各10只。TSG干預(yù)組于造模成功后1 w給予TSG腹腔注射，劑量分別為10和20 mg/kg。對(duì)照組大鼠10只，腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液，所有動(dòng)物8 w處死。
　　1.3 大鼠腎系膜細(xì)胞培養(yǎng)和分組

　　培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，常規(guī)置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每周傳代2～3次。分組：正常對(duì)照組(NG，葡萄糖5.5 mmol/L)，高糖組(HG，葡萄糖30 mmol/L)，HG+TSG(1、5、25、100 μmol/L)組，甘露醇組(5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)。
　　1.4 生化指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)測(cè)定

　　血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)采用Beckman全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，血糖采用血糖測(cè)定儀，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定24 h尿蛋白排泄量檢測(cè)。腎組織中SOD、MDA及GSHPx，操作按試劑盒(南京建成)說明書進(jìn)行。
　　1.5 MTT法檢測(cè)GMCs增殖活性
　　取對(duì)數(shù)期大鼠GMCs，每孔2～4×104細(xì)胞接種于96孔板上，12 h待細(xì)胞亞融合后改0.5%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化。棄上清，按上述方法分組給藥，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，處理48 h，于實(shí)驗(yàn)終止前4 h每孔加10 μl(5 mg/ml)MTT。4 h后用吸凈上清液，加入100 μl DMSO，振蕩10 min于酶標(biāo)儀上570 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。TSG共孵育組在實(shí)驗(yàn)前均用臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞均大約90%，排除了TSG的細(xì)胞毒作用。
　　1.6 Western印跡檢測(cè)
　　取對(duì)數(shù)期GMCs接種于50 ml培養(yǎng)瓶，12 h后改用0.5%血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化。按上述分組給藥，作用48 h后，細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，蛋白含量用改良lowry法測(cè)定。取總蛋白75 μg經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果并標(biāo)出相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。然后用5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h。洗膜后加入一抗(Santa Cruz公司，1∶500稀釋)4℃過夜。再用辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗小鼠多抗(1∶500稀釋)雜交1 h;洗膜后加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)，然后將硝酸纖維膜放入X光片暗盒，壓片，顯影，定影。
　　1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用方差分析。
　　2 結(jié) 果
　　2.1 TSG對(duì)DN大鼠血糖、TC、TG、腎功能、24 h尿蛋白排泄量、腎重/體重的影響
　　DN組大鼠明顯多飲，多食，多尿，生長(zhǎng)減慢，體重減輕，TC、TG、Cr、BUN、24 h尿蛋白排泄量(UAE/24 h)升高(P<0.01)。TSG干預(yù)后能緩解上述生化指標(biāo)的改變，與DN組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，以大劑量TSG干預(yù)效果更明顯。TSG干預(yù)組血糖(BG)值與DN組比較有所下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。DN組大鼠腎重/體重(KW/BW)明顯升高，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，TSG干預(yù)后KW/BW比值出現(xiàn)下降趨勢(shì)，與DN組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)。見表1。表1 TSG對(duì)糖尿病腎病大鼠血糖、三酰甘油、總血尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白排泄量和腎重/體重的影響
　　2.2 TSG對(duì)糖尿大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響
　　8 w時(shí)DN組大鼠SOD活性、GSHPx活性均下降、MDA含量升高(P<0.01);小劑量TSG干預(yù)可使SOD，GSHPx活性升高(P<0.05)， 大劑量TSG干預(yù)使上述指標(biāo)進(jìn)一步改善外，還可見MDA含量顯著下降(P<0.05)。見表2。表2 TSG對(duì)糖尿大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響
　　2.3 TSG對(duì)糖尿大鼠腎臟TGFβ1和SIRT1蛋白表達(dá)的影響
　　DN組大鼠腎皮質(zhì)TGFβ1蛋白表達(dá)明顯增加，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，TSG干預(yù)后TGFβ1蛋白表達(dá)量明顯下降。而DN組大鼠腎皮質(zhì)SIRT1蛋白表達(dá)明顯下降，TSG干預(yù)能緩解SIRT1蛋白表達(dá)下調(diào)，以TSG大劑量干預(yù)組效果明顯。見圖1。圖1 TSG對(duì)大鼠腎臟TGFβ1、SIRT1蛋白的影響圖2 TSG對(duì)高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞TGFβ1、SIRT1表達(dá)的影響
　　2.4 TSG對(duì)高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞增殖的影響
　　高糖環(huán)境對(duì)系膜細(xì)胞在培養(yǎng)48 h時(shí)有刺激系膜細(xì)胞增殖的效應(yīng)(164.5±15.4)，1，5，25，100 μmol/L的TSG均能抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增生(156.8±13.4，147.6±12.7，129.7±12.9，111.9±13.1)(P<0.05)，且隨著劑量的增加，其抑制作用增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，呈劑量依賴性關(guān)系。
　　2.5 TSG對(duì)高糖刺激的系膜細(xì)胞SIRT1和TGFβ1蛋白表達(dá)的影響
　　體外培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)高糖能誘導(dǎo)系膜細(xì)胞TGFβ1蛋白表達(dá)上調(diào)，SIRT1蛋白表達(dá)下降，甘露醇組SIRT1和TGFβ1蛋白變化不明顯，說明高糖激活SIRT1和TGFβ1蛋白變化與高滲無關(guān)，而高劑量TSG預(yù)處理后能逆轉(zhuǎn)高糖引起的SIRT1和TGFβ1蛋白變化。見圖2。
　　3 討 論
　　何首烏被人們認(rèn)為是延年益壽、延緩衰老之功效，系的滋補(bǔ)中藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，何首烏具有多種生物學(xué)功效〔5〕。TSG是何首烏中提取的一種具有顯著藥理活性水溶性有效成分，與SIRT1激活劑resveratrol具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而resveratrol可通過調(diào)節(jié)氧化性損傷糾正DN大鼠腎功能紊亂〔6〕。目前研究表明活性氧(ROS)在DN發(fā)生發(fā)展中起著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，可通過激活TGFβ1、血管緊張素Ⅱ、蛋白激酶C和絲裂原激活蛋白激酶等作用而參與DN發(fā)生和發(fā)展〔7〕。腎組織過氧化產(chǎn)物堆積、內(nèi)在抗氧化酶活性降低在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本結(jié)果顯示TSG對(duì)糖尿病大鼠腎臟具有明顯的抗氧化作用，并呈劑量依賴的方式。同時(shí)TSG可調(diào)節(jié)糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，降低尿蛋白排泄率，緩解DN損害。
　　SIRT1是一種具有NAD2依賴的蛋白去乙?；富钚缘亩喙δ苻D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子， 在體內(nèi)參與調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞壽命的不同信號(hào)通路及糖代謝，胰島素分泌等多條代謝途徑。SIRT1 在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，當(dāng)熱量限制或禁食時(shí)，在腦、脂肪、腎臟、肌肉以及肝臟中水平上調(diào)。目前認(rèn)為SIRT1是調(diào)控高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量及功能的關(guān)鍵因子〔8〕，熱量限制能夠通過激活SIRT1從而對(duì)2型糖尿病有防治作用，并認(rèn)為SIRT1是防治糖尿病及相關(guān)性疾病的重要靶點(diǎn)之一〔3，4〕。本研究以大鼠DN模型和高糖環(huán)境下培養(yǎng)的系膜細(xì)胞為對(duì)象，體內(nèi)外探討了TSG對(duì)DN的保護(hù)作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)DN大鼠和高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞，均可抑制SIRT1蛋白表達(dá)，而TSG預(yù)處理能逆轉(zhuǎn)SIRT1蛋白低表達(dá)。
　　DN損害是多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子作用的結(jié)果，其中以TGFβ1為核心因子，是DN發(fā)病機(jī)制的后共同通路〔7，9〕。目前認(rèn)為TGFβ1可促使腎小球肥大和細(xì)胞為基質(zhì)的堆積，并可通過多種途徑損傷腎小球?yàn)V過屏障及促使腎間質(zhì)纖維化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在DN大鼠模型和高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞中TGFβ1均高表達(dá)，但是TSG可逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。推測(cè)TSG對(duì)TGFβ1的調(diào)節(jié)作為可能與其激活SIRT1蛋白和氧化應(yīng)激有關(guān)，但具體的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。總之，通過以上研究將有利于拓寬對(duì)DN發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，建立新的藥物作用靶點(diǎn)，尋求新的有效制劑，為中醫(yī)藥防治DN提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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