血漿miR-206在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

　　局部微環(huán)境缺氧是結(jié)腸癌進(jìn)程中比較明顯的現(xiàn)象?；铙w內(nèi)芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)子(ARNT)是許多堿性螺旋一環(huán)一螺旋(bHLH)-PAS蛋白共同的專性二聚化配偶體，其中芳香烴受體(AhR)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1a,2a和3a等均需一jARNT亞基結(jié)合后才能參與機(jī)體內(nèi)許多與缺氧有關(guān)的重要的生物學(xué)過程斷。 　　

　　我們通過篩選出有效沉默人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞ARNT基因表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)，建立穩(wěn)定沉默ARNT基因的HT29細(xì)胞株。 　　

　　材料與方法 　　

　　1.材料:干擾序列dsDNAoligo，購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司;T4DNAIigase,AgeI和EcoRI，購(gòu)自NEB公司;QiagenPlasmid大抽試劑盒，購(gòu)自Qiagen公司，陽(yáng)性克隆測(cè)序由美季生物公司完成;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine2000，購(gòu)自Invitrogen公司;Taq聚合酶、RNAisoPlus,Primesc[x]ript)RTreagent試劑盒和SYBR.PremixExTaqT}t，購(gòu)自TaKaRa公司;DMEM和RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清，購(gòu)自Gibc。公司;RIPA裂解液、二喳琳甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒和階肌動(dòng)蛋白抗體，購(gòu)自Beyotime公司;WesterningPlus一增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)，購(gòu)自Piers二公司;、R\丁抗體，購(gòu)自Proteintech公司。‘漫病毒載體(LV)系紐刃上海吉?jiǎng)P公司產(chǎn)品，由目的慢病毒載體GV115(元性五序:huh-MCS-CMV-EGPP),pHelper1.0載體和}}Helper2.0載體3質(zhì)粒組成。HT29結(jié)腸癌細(xì)胞株購(gòu)自上海拜力生物公司(第3代);包裝慢病毒細(xì)胞株293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);大腸桿菌菌株DHS。購(gòu)于上海超研生物利一技有限公司。 　　

　　2.構(gòu)建表達(dá)ARNT短發(fā)卡RNA(shRNA)的慢病毒載體并測(cè)序鑒定:針對(duì)目的基因序列(GeneID;405)，利用公用網(wǎng)站中提供的RNA十?dāng)_序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)多個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列，根據(jù)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行評(píng)估測(cè)定，選擇佳的動(dòng)力學(xué)參數(shù)靶點(diǎn)，確定有效干擾ARNT基因的靶點(diǎn)序列:5'-TTGTCCAGAGGGCTATT}A-3',命名為L(zhǎng)V-ARNT-RNAi一1;5’-CTACACTCTCC.AACACAA1'-3’，命名為L(zhǎng)V-ARNT-RNAi-2;5'-GAAGTCAGATGGTT-I一}Pl'T_3'，命名為L(zhǎng)V-ARNT-R11}Ai-3;5'-CCTGA"工-}_}TI:GTTCAAGTT-3'，命名為L(zhǎng)V-ARNT-RNAi-}:用Fi\}干擾實(shí)驗(yàn)中的RNAi陰性對(duì)照(NC)}cramhle序幾「5’-T"fCTCCGAACGTG'1'C_ACGT-3')作為陰性對(duì)井.扮名為L(zhǎng)V-ARNT-RNAi-n。設(shè)計(jì)并分t}」合成其}:nPWA的單鏈DNAOligo(內(nèi)含AyeI和EcuRI酶切位點(diǎn))經(jīng)退火形成雙鏈DNA，通過T4DNA連接酶與4geI和EcaRI酶切后的GV115載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHSa，挑取轉(zhuǎn)化子，使用GV115通用引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PGR)，將PGR陽(yáng)性克隆行測(cè)序鑒定。 　　

　　3.慢病毒包裝:提取慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質(zhì)粒D\A轉(zhuǎn)染前24h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為6x108/L，接種于15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)-h待細(xì)胞密度達(dá)70%一80%時(shí)，按Lipofectamine-i1r)0說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞上青夜，離心濃縮后一80℃保存。 　　

　　4.慢病毒滴度測(cè)定:轉(zhuǎn)染前1d,293T細(xì)胞按4x108/L,100閃每孔接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，對(duì)待測(cè)定的病毒原液進(jìn)行7次10倍梯度稀釋。第1次10倍稀釋，所得病毒原液為第1個(gè)Ep管中的1/10，病毒原液量記為1E+0閃;第7次10倍稀釋，病毒原液量記為1E-6閃。轉(zhuǎn)染4d后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)，病毒滴度=帶有熒光的細(xì)胞數(shù)/病毒原液量，單位為TU/ml。 　　

　　5.重組慢病毒轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞效率檢測(cè):分別以感染復(fù)數(shù)(MO1)=150,100,50,25,15和10的LV-ARNT-RNAi-nc慢病毒轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞。培養(yǎng)72h后制備細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用佳MOI}
　　6.重組慢病毒轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞及分組:細(xì)胞分為空白對(duì)照、LV-ARNT-RNAi-nc;,LV-ARNT-RNAi-1,LV-ARNT-RNAi-2、LV-ARNT-RNAi-3和LV-ARNT-RNAi6組。轉(zhuǎn)染前1d將HT29細(xì)胞接種至6孔板中，1x105個(gè)/孔，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合達(dá)到30%一40%。轉(zhuǎn)染時(shí)，MOI-100，病毒感染的同時(shí)加人工作液濃度為5群L的聚凝胺。72h后倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。將慢病毒感染成功的細(xì)胞通過有限稀釋法接種于96孔板，待形成境界清楚的克隆，挑取有熒光的單克隆至24孔板中，擴(kuò)大培養(yǎng)。 　　

　　7.驗(yàn)證內(nèi)源靶點(diǎn):用來構(gòu)建慢病毒載體的表達(dá)質(zhì)粒GV115載體，帶有GFP。提取RNA或蛋白前，每個(gè)樣本隨機(jī)選擇3個(gè)觀察點(diǎn)拍照(放大200倍)，通過陰陽(yáng)對(duì)比圖，粗略計(jì)數(shù)帶熒光細(xì)胞占總細(xì)胞比例。 　　

　　8.引物有效性鑒定:配置1%瓊脂糖凝膠制板，將電泳樣品依次點(diǎn)人加樣孔中，將制膠板放人電泳槽中，加人電泳液1xT-1E,士J一少干電泳儀，電壓100V,30minx電泳結(jié)束，嗅化乙錠溶液中染色巧min，清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果，照相記錄。 　　
　　9.2as法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量的有效性驗(yàn)證:按加人('DNA模板起始量分為0.1,0.5,1.0,2.。閃共4組，每組6個(gè)復(fù)孔，其中一半復(fù)孔加ARNT引物，另一半加人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)，重復(fù)3次。計(jì)算出ARN'1和GAPDH的△CT值，通過cDNA濃度梯度的log值對(duì)△C1'值作圖，得直線相關(guān)系數(shù)r},假設(shè)檢驗(yàn)Ho:P-0，即c}DN;A模板濃度與△CT值之間無線性相關(guān)關(guān)系，H,}p}0,即cDNA模板濃度與△CT值之間有線性相關(guān)(a=0.O5)如果所得a>0.05，說明目的基因和內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率相同，可以通過2-vvct法進(jìn)行相對(duì)定量。 　　

　　10.PCR檢測(cè)HT29細(xì)胞ARNTmRNA表達(dá)水平:提取細(xì)胞總RNA后，檢測(cè)其吸光度(Azeo}Azso)值，逆轉(zhuǎn)錄成cDNAARNT正義鏈5'-TCATCTCCCGACA-CAACATT-3’和反義鏈5'-AAGCTGCTGGTCTTCAG-GAT-3',擴(kuò)一增產(chǎn)物大小為134帥;人GAPDH正義鏈5'-GTCGGTGTGAACGGAT'IT-3’和反義鏈5'-ACTC-CACGACGTACTCAGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為276by。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。按SYBR.
　　PremixExTaq試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃30s;PCR反應(yīng)950C30s,600C34's,40個(gè)循環(huán)。用溶解曲線確定產(chǎn)物特異性。以G.APDH為內(nèi)參照，以2一“ACl法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量,mRNA的相對(duì)變化量公式為:干擾效率=1-2一“}c}。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 　　

　　11.westernblot檢測(cè)ARNT蛋白表達(dá)水平:收集細(xì)胞，抽提蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。 　　

　　封閉后，加人ARNT抗體和兔抗p-actin多克隆抗體(1:1800)，置于4℃雜交過夜。次日，加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1:2000)，室溫反應(yīng)1h。檢測(cè)雜交信號(hào)。測(cè)量顯影片的灰度值，以卜actin基因作為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以空白對(duì)照組做為參照樣本，計(jì)算其余各組蛋白的相對(duì)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 　　

　　12.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x士、)表示，采用One'ayANOVA檢驗(yàn)。 　　

　　結(jié)果
　　1.陽(yáng)性克隆的測(cè)序鑒定:測(cè)序結(jié)果表明合成的ARNT-shRNA核昔酸序列插人正確，無堿基缺失和替換。對(duì)測(cè)序結(jié)果正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，測(cè)重組慢病毒質(zhì)粒DNA,上}o/Aza。值為1.8一1.9，說明質(zhì)粒DNA的純度和完整性很高)。 　　

　　2.重組慢病毒的滴度:提取獲得的慢病毒液滴度為L(zhǎng)V-ARNT-RNAi一1、1.OE+9TU/ml，LV一ARNT-RNAi-2,6.OE+8TU/ml，LV-}4RNT-RNAi-3、6.OE+8TU/ml，LV-ARNT-RNAi-},8.OE+8TU/ml，LV-ARNT-RNAi-nc}1.OE+9TU/ml。說明有大量質(zhì)粒轉(zhuǎn)人293T細(xì)胞，病毒包裝成功。 　　
　　

　　3.佳MOI的獲取:MOI-0,10,15,25,50,100和150時(shí)，轉(zhuǎn)染效率依次為0,25.82%,35.90%,53.50%,64.59%,75.90%,78.50%。隨著MOI的遞增，轉(zhuǎn)染效率增加明顯減慢，考慮慢病毒用量，確定MOI=100為佳轉(zhuǎn)染條件。 　　

　　4.內(nèi)源靶點(diǎn)驗(yàn)證:在熒光顯微鏡下觀察5組克隆篩選獲取的轉(zhuǎn)染慢病毒細(xì)胞株，可以觀察到發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞比例大于90%，認(rèn)為感染效率達(dá)到要求，可以收集細(xì)胞提取總RNA和總蛋自進(jìn)入后續(xù)篩選實(shí)驗(yàn)。 　　

　　5.引物檢測(cè)結(jié)果:電泳結(jié)果顯示產(chǎn)物分子大小和理論值一致，未見非特異性條帶，說明引物有效(圖1)。 　　

　　6.(a法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量的有效性驗(yàn)證結(jié)果::=0.0451，根據(jù)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量t值公式，所得t值為0.0638,v二z，查t界值表，得。大于0.05，接受Ho，說明目的基因和內(nèi)標(biāo)基因打一增效率相同，可用2-}oc}法進(jìn)行相對(duì)定量。 　　

　　7.PCR檢測(cè)結(jié)果:LV-ARNT-RNAi-3重組慢病毒轉(zhuǎn)染人HT29結(jié)腸癌細(xì)胞后對(duì)ARNTmRNA表達(dá)敲減效率達(dá)70%左右(表1)。擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析表明對(duì)ARNT和GAPDH基因進(jìn)行了有效而準(zhǔn)確的擴(kuò)增。I}unnett'sT3法:LV-ARNT-RNAi-nc和陰性對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),LV-ARNT-RNAi-l,LV-ARNT-RNAi-2和LV-ARNT-RNAi}組分別與LV-ARNT-RNAi-nc組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),LV-ARNT-RNAi-3分別與LV-ARNT-RNAi-nc和陰性對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義‘P<0.05)。 　　

　　8.LV-ARNT-RNAi-3下調(diào)HT29細(xì)胞的ARNT蛋白表達(dá)水平:Westernblot結(jié)果顯示LV-ARNT-RNAi-3組的ARNT蛋白表達(dá)量明顯低于其他各組，蛋白相對(duì)表達(dá)水平下降達(dá)60%(表2，圖2)oLSD法:LV-ARNT-RNAi-1,LV-ARNT-RNAi}nc分別與陰性對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.O5),LV-AR\T-RNAi-3分別與LV-ARNT-RNAi-nc和陰性對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.O5)。 　　

　　討論
　　目前常用的RNA干擾載體中，轉(zhuǎn)染慢病毒載體是實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期RNA干擾并獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的佳方法。本實(shí)驗(yàn)對(duì)人ARNT基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)并合成了4對(duì)shRNA,測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了ARNT-shRNA慢病毒表達(dá)載體。合成的5組重組慢病毒滴度在6x10}-1x109TU/ml之間。木實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靶點(diǎn)不同，沉默效果不同，這說明慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾效率與所選擇的干擾靶點(diǎn)有關(guān)。在慢病毒介導(dǎo)RNA干擾No}o受體基因治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究中，目的基因沉默效率達(dá)到60%左右時(shí)，可以對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。我們?cè)O(shè)計(jì)的LV-ARNT-RNAi-3重組慢病毒明顯下調(diào)ARNT的mRNA和蛋白的表達(dá)，基因沉默效率達(dá)60%以上，為探討ARNT基因?qū)Y(jié)腸癌的生物特性影響奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 　　

　　參考文獻(xiàn) 　　

　　He L,Hannon GJ. MiRNA:small RNAs with a big role in gene regulation[J].Nature Reviews Genetics,2004.522-531.
　　Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM. Circulating miRNA as stable blood-ba[x]sed markers for cancer detection[J].Proceedings of the National Academy of Sciences(USA),2008.10513-10518.
　　龔文容,盧曉明,陳志松. miR-145在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)及臨床意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2011,(1):35-36.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.01.011.
　　張鵬,周總光,王玲. 直腸癌組織中miR-155和miR-200c的表達(dá)差異及意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2010,(1):59-61.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.01.025.
　　曾俊杰,孫凱,吳承堂. 結(jié)直腸癌與毗鄰癌旁組織中microR-NA-221與CDKN1 C/p57的差異表達(dá)[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2011,(1):19-21.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.01.005.
　　于振濤,蔡星,尚曉濱. microRNA在結(jié)腸癌組織的表達(dá)及其臨床意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2008,(7):894-896.doi:10.3321/j.issn:1001-9030.2008.07.029.
　　Varkonyi-Gasie E,Hellens RP. Quantitative stem-loop RT-PCR for detection of miRNA[J].Methods in Molecular Biology,2011.145-157.
　　Hurley J,Roberts D,Bond A. Stem-loop RT-qPCR for microRNA ex[x]pression profiling[J].Methods in Molecular Biology,2012.33-52.
　　Ng EK,Chong WW,Jin H. Differential ex[x]pression of miRNA in plasma of patients with colorectal cancer:a potential marker for colorectal cancer screening[J].Gut,2009.1375-1381.
　　Cheng H,Zhang L,Cogdell DE. Circulating plasma MiR-141 is a novel biomarker for me[x]tastatic colon cancer and predicts poor prognosis[J].PLoS One,2011.e17745.