慢病毒介導(dǎo)LIGHT基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116中的表達(dá)

         成熟微小RNA(miRNA)是真雄生物中一類高度保守的小片段非編碼的RNA，參與細(xì)胞的增殖、分化等基本活動(dòng)。研究結(jié)果顯示miRNA可以充當(dāng)抑癌基因和原癌基因作用，參與多種腫瘤的形成和發(fā)展。近研究顯示，循環(huán)血中存在miRNA，并且這些miRNA不易被RNase降解，腫瘤起源的miRNA與正常比較存在差異，因此有望作為腫瘤標(biāo)志物指導(dǎo)臨床實(shí)踐。在結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種miRNA表達(dá)異常，并且這些miRNA與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)，具有潛在的輔助診斷和預(yù)后評(píng)估的意義。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于結(jié)直腸癌血漿差異miRNA的研究報(bào)道尚少。我們采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)陣列法篩選結(jié)直腸癌血漿中差異表達(dá)的miRNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，并探討其在結(jié)直腸癌中的價(jià)值。 　　
         材料與方法 　　
         1一般資料:收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院消化內(nèi)科2009年1月至2012年5月收治的36例結(jié)直腸癌患者外周血，標(biāo)本獲得前患者未經(jīng)任何手術(shù)及放化療治療，無合并癥，患者均經(jīng)病理檢查確診，無其他腫瘤病史，其中男21例，女15例;年齡42一86歲，平均年齡67歲;腺癌32例，戮液腺癌4例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例;按照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)第六版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，其中fl期14例，111期19例，W期3例;另外，收集同期在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院門診26例健康體檢者外周血，均證實(shí)無腫瘤病史，其中男性11例，女性15例;年齡48一77歲，平均年齡64歲，結(jié)直腸癌患者和健康體檢者年齡和性別匹配(P>0.05),所有標(biāo)本的采集均獲得本人的知情同意。 　　
         2.方法:(1)血漿樣本的收集:收集待檢者2ml外周血迅速轉(zhuǎn)人乙二胺四乙酸(EDTA)采血管中，在室溫下靜置15一30min,4℃1760xg離心10min，小心吸取上清到潔凈的1.5m1離心管中，一80℃冰箱中保存(2)血漿中總RNA的提取:取上述血漿樣本400p,l，按小RNA提取(mirVanamiRNAIsolation，美國(guó)AppliedBiosystem公司)試劑盒方法抽提總RNA，取1p,lRNA，在NanoDropND一1000Spectrophotometer儀(美國(guó)NanoDrop公司產(chǎn)品)測(cè)定濃度，-80℃冰箱中保存。(3)TaqMan.PCR陣列方法檢測(cè)血漿樣本中miRNA的表達(dá):隨機(jī)選取7例結(jié)直腸癌患者血漿RNA(TNM分期:11期3例、l期3例、W期1例;腺癌6例、黍占液腺癌1例)及6例健康體檢者血漿RNA3閃，根據(jù)小RNA逆轉(zhuǎn)錄引物庫(kù)(MegaplexHumanPool，美國(guó)AppliedBiosystem公司)配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件:16℃2min,42℃1min,500C1s循環(huán)40次;85℃5min。因血漿中RNA峰度值低，因此將產(chǎn)物預(yù)擴(kuò)增。 　　
        

          取2.5閃逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，按照預(yù)擴(kuò)增混合物(TaqManPreAmpMasterMix，美國(guó)AppliedBiosystem公司)說明書配置體系，反應(yīng)條件:95℃預(yù)熱10min;55℃2min;72℃2min;95℃15s,60℃4min循環(huán)12次;99.90C10min。產(chǎn)物用75p,10.1xTEpH8.0稀釋，一200C保存。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR混合物(TaqManUniversalPCRMasterMix,NoAmpEraseUNG，美國(guó)AppliedBiosystem公司)說明配制體系，取100p,1上樣于PCR陣列上(TaqMan.HumanMicroRNAArray，美國(guó)AppliedBiosystem公司),314xg離心1min2次，用Real-timePCRAB7900HT反應(yīng)，條件為:94.5℃10min;97℃30s,59.7℃1min循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算各反應(yīng)管內(nèi)的Ct值。(4)Real-timePCR驗(yàn)證TaqMan}PCR陣列檢測(cè)結(jié)果:分別取29例結(jié)直腸癌患者血漿總RNA和20例健康體檢者血_漿總RNA5閃，根據(jù)小RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaqManMicroRNAReverseTransc[x]ription，美國(guó)AppliedBiosystem公司)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)條件:160C30min,420C30min,850C5min。取2.5p,1逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，按照TaqMan.PreAmpMasterMix(美國(guó)AppliedBiosystem公司)說明書進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。產(chǎn)物加人75閃O.1xTEpH8.0稀釋。以eDNA為模板，應(yīng)用TaqManUniversalPCRMasterMix試劑盒(美國(guó)AppliedBiosys-tem公司)在Real-timePCRAB7500儀上進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)，以U6小核RNA為內(nèi)參，引物的序列依據(jù)http;//www.mirba[x]se.org(表1)，由上海英杰公司合成，用稀釋的產(chǎn)物1閃，引物1閃，配成20閃的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件:950C10min,950C15s,60℃60s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)靶點(diǎn)重復(fù)3次反應(yīng)結(jié)束由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算各反應(yīng)管內(nèi)的Ct值.
　　3.統(tǒng)計(jì)一學(xué)方法:MicroRNA表達(dá)水平采用相對(duì)定量方法，即計(jì)算OCt=CtR}、一CtL6來表示相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算D}Ct=OCt}病例組;一OCt。對(duì)照繃，以2一“蜘表示每個(gè)miRNA的變化倍數(shù)，再將結(jié)果轉(zhuǎn)化為1og10的對(duì)數(shù)形式。利用多重比較檢驗(yàn)分析TaqMan.MicroRNAArray結(jié)果，建立隨機(jī)方差模型(RVM)，借助分析工具為TwoClassDif，對(duì)兩組進(jìn)行比較，計(jì)算MicroRNA間差異的顯著性水平(P值)和誤判率(FDR)，得到差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的MicroRNA;應(yīng)用SPSS16.0軟件對(duì)Real-timePCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)表示方法為均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示;組間比較采用t檢驗(yàn);聚類分析采用Cluster3.0軟件進(jìn)行;通過logistic回歸分析尋找佳血漿中miRNA的組合。 　　

           結(jié)果
　　1.TaqMan.PCR陣列檢測(cè)血漿中miRNA的表達(dá):根據(jù)7例結(jié)直腸癌患者和6例健康體檢者TaqMan MicroRNAArray檢測(cè)結(jié)果繪制箱式圖發(fā)現(xiàn)患者6信號(hào)值范圍與其他樣本差異大，將其剔除。在P<0.05,FDR<0.05的條件下共篩選出42個(gè)結(jié)直腸癌特異性血漿差異miRNA，其中20個(gè)miRNA在患者血漿中表達(dá)增高，22個(gè)miRNA在患者血漿中表達(dá)降低。利用Cluster3.0軟件對(duì)42個(gè)差異miRNA進(jìn)行聚類分析，其中6例患者和5例健康人能夠被正確的分開，正確劃分率分別為85.7%和83.3%。進(jìn)一步提高篩選條件，在Foldchange>1.0，且P<0.05條件下共篩選出16個(gè)結(jié)直腸癌特異性血漿miRN.9，進(jìn)行驗(yàn)證研究。見表2。 　　

         2.Real-timePCR驗(yàn)證TaqMan.PCR陣列檢測(cè)結(jié)果:檢測(cè)結(jié)果見表3,2個(gè)miRNA在患者血漿中表達(dá)增高，14個(gè)miRNA在患者血漿中表達(dá)降低。其中miR-125b,miR-375、miR-150、miR-206與TaqVIan⑧MicroRNAArray檢測(cè)結(jié)果一致，表達(dá)均降低，且與健康體檢者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.OS);miR-126#,miR-378,miR}183-Sp,miR-520c-3p雖與健康體檢者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但表達(dá)水平與TaqMan.MicroRNAArray檢測(cè)結(jié)果不符;miR-342-3p,miR-127,let-7b,miR}09-3p表達(dá)水平與TaqManMicroRNAArray檢測(cè)結(jié)果相符，但與健康體檢者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P>0.OS)。miR-126,miR-24,miR-146a,miR-7d表達(dá)水平與TaqMan.MicroRNAArray檢測(cè)結(jié)果不符，并與健康體檢者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在后續(xù)分析中排除miR-126#,miR-378,miR-483-Sp,miR-520c-3p,miR-342-3p,miR-127、let-7b、miR}09-3p}miR-126、miR-24,miR-146a,let-7dologistic回歸尋找佳microRNA組合時(shí)發(fā)現(xiàn)只有miR-206進(jìn)人到回歸模型中，表明miR-206表達(dá)水平對(duì)區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康體檢者意義更大，即在其他因素不變的條件下，miR-206每增加1個(gè)單位，發(fā)生結(jié)直腸腫瘤風(fēng)險(xiǎn)增加為原來的0.29倍[比值比(OR)=0.29,95%可信區(qū)間(CI);0.12一0.67];根據(jù)每個(gè)樣本的TNM分期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-206在結(jié)直腸癌的早期就會(huì)出現(xiàn)明顯的表達(dá)下降，與健康志愿者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 　　

         討論
　　miRNA在結(jié)直腸癌中的研究大多應(yīng)用組織標(biāo)本，曾俊杰等`5〕研究表明miR-221在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，而于振濤等困研究表明組織表達(dá)異常的miRNA可以用作結(jié)直腸癌的早期診斷。近幾年，由于檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展〔78〕，可以將這些含量少的血漿miRNA應(yīng)用快速、特異、高通量的手段檢測(cè)出來。Ng等L9〕早在患者血漿中發(fā)現(xiàn)miR-17a-3p和miR-92a在結(jié)直腸癌患者血漿中高表達(dá)，術(shù)后7d表達(dá)水平下降。Cheng等「‘“」研究表明miR-141與腫瘤的TNM分期有關(guān)，是轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素。之后，越來越多的研究結(jié)果顯示循環(huán)血miRNA對(duì)腫瘤早期診斷、分期、預(yù)后評(píng)估等方面具有重要的提示作用這些結(jié)果均提示循環(huán)miRNA作為一種非侵人性的診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的腫瘤標(biāo)志物具有很好的應(yīng)用前景。本研究通過PCR陣列法初步篩選并用Real-timePCR進(jìn)行驗(yàn)證，終發(fā)現(xiàn)與健康人比較，miR-125b,miR-375,miR-150,miR-206在結(jié)直腸腫瘤患者血漿中表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-206對(duì)區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康體檢者意義更大，在結(jié)直腸癌患者血漿中表達(dá)降低，并且腫瘤早期就出現(xiàn)明顯的下降。在已報(bào)道的文獻(xiàn)中，Vickers等一‘“es研究結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)miR-206在腫瘤組織中表達(dá)減低，5種miRNA(miR-21,135a,335,206,let-7a)聯(lián)合評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的敏感性是76}/o，特異性是87plc，有望作為預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。在其他腫瘤中也發(fā)現(xiàn)miR-206的作用。fang等在非小細(xì)胞肺癌組織發(fā)現(xiàn)miR-206在腫瘤組織和細(xì)胞株中表達(dá)降低，并且與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力呈負(fù)相關(guān)。在另一項(xiàng)喉鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-206通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子發(fā)揮抑癌基因的作用一，6〕。 　　

         在腫瘤患者體液中研究miR-206的表達(dá)目前報(bào)道不多，有報(bào)道指出組織和血漿或血清中miRNA表達(dá)常存在不一致的地方，這種不一致可能由多種機(jī)制引起，到目前仍不是很清楚。本研究結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌患者血漿中miR-206表達(dá)量降低，與組織標(biāo)本文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，并且在腫瘤的一早期階段就會(huì)出現(xiàn)，說明miR-206可能參與腫瘤形成的過程，為早期診斷結(jié)直腸癌提供了非侵人性的手段.
　　參考文獻(xiàn) 　　

         Mauri DN,Ebner R,Montgomery RI. LIGHT,a new member of the TNF superfamily,and lymphotoxin alpha are ligands for herpesvirus entry mediator[J].Immunity,1998.21-30.
　　Zhai Y,Guo R,Hsu TL. LIGHT,a novel ligand for lymphotoxin beta receptor and TR2/HVEM induces apoptosis and suppresses in vivo tumor formation via gene transfer[J].Journal of Clinical Investigation,1998.1142-1151.
　　Morel Y,Schiano de Colella JM,Harrop J. Reciprocal ex[x]pression of the TNF family receptor herpes virus entry mediator and its ligand LIGHT on activated T cells:LIGHT down-regulates its own receptor[J].Journal of Immunology,2000.4397-4404.
　　劉相萍,王海波,劉延軍. RhoA、RhoC基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2008,(7):888-890.doi:10.3321/j.issn:1001-9030.2008.07.027.
　　Gilboa E. How tumors escape immune destruction and what we can do about it[J].Cancer Immunology Immunotherapy,1999.382-385.
　　黃潔夫,汪謙. 分子生物學(xué)技術(shù)在外科的地位[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,1998.481-482.
　　Wiznerowicz M,Trono D. Harnessing HIV for therapy,basic research and biotechnology[J].Trends in Biotechnology,2005,(1):42-47.doi:10.1016/j.tibtech.2004.11.001.
　　孟春暉,李福年,張佃良. c-myc基因慢病毒載體的構(gòu)建及其意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2011,(4):543-546.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.04.022.