持續(xù)高表達(dá)CXC趨化因子受體-4重組慢病毒顆粒的包裝鑒定及細(xì)胞遷移

          CXC趨化因子受體-4(CXCR4)是趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子一1(SDF-lcx)的特異受體.有研究表明,SDF-1cx/CXCR4軸可以促進(jìn)細(xì)胞遷移「23],并且可以促進(jìn)細(xì)胞存活,抑制細(xì)胞凋亡.本實驗旨在構(gòu)建持續(xù)高表達(dá)CXCR4的慢病毒載體及慢病毒顆粒包裝鑒定,并探討體外細(xì)胞遷移,試圖通過慢病毒載體及SDF-1a/CXCR4軸使持續(xù)高表達(dá)的基因治療和細(xì)胞治療相結(jié)合.
          材料與方法 
          1.材料:第3代4質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)來源于南開大學(xué).大腸桿菌DH5a感受態(tài)購買自Tiangen公司.Taq酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶XbaT,EcoRT均購自TaKaRa公司.膠回收試劑盒購自Axygen公司.胎牛血清、DMEM、胰酶一乙二胺四乙酸(EDTA)、青霉素、鏈霉素均購自Gibc.公司,Transwell小室為Corning-Corstar3422(美國).
          2.建立大鼠cDXA文庫:取50gSDnistar大鼠大腦組織,立即放入液氮中,加Trizol100g/L,碾磨均勻,4℃12000g離心10min,吸上清,室溫放置5min,按每1mlTrizol加0.2ml氯仿混勻,室溫放置3min,4℃12000g離心15min,吸上清重復(fù)4℃I2000g離心15min,吸上清,按1mlTrizol加0.5ml異丙醇,冰浴15min,40C12000g離心10min棄上清,用70%乙醇漂洗2次,加乙醇4℃7500g離心10min,棄上清,室溫干燥,適量焦磷酸二乙醋(DEPC)H,0溶解,一20℃保存.提取的RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲得大鼠cDNA文庫,反應(yīng)體系為:SxRT緩沖液8N.,l,10m,二dNTP2}1,OligoldT(20N,,m)2},1,模板10p,1,MMLV2p,1,DEPCHZ016p,1共40p,1,反應(yīng)條件為:420C60min,950C5min.
          3.PCR獲得目的基因CXCR4:以SDWistar大鼠為模板通過PCR獲得大鼠CXCR4基因,目的基因引物為:上游引物5'-GCTCTAGAGCATGGAAATATA-CACTTCGGAT-3';下游引物5'-GGAATTCC`I"1'AGC'1'G-GAGTGAAAACTTGAG-3';反應(yīng)條件:DNA變性溫度為:98℃30s;退火溫度為63℃30s;延伸溫度為72℃90s.反應(yīng)體系為:ddHzO34.61a,1,10xTag緩沖液5閃,dNTP4閃,上游引物2閃,下游引物2閃,cDNA模板2},l,Taq酶0.5p,1,總量為50μ1.
          4.構(gòu)建pCDHl-CXCR4-EF1-copGFP慢病毒載體質(zhì)粒:用回收試劑盒回收CXCR.4基因片段,CXCR4純化后基因片段與pCDHl-MCS-EF1-copGFP用XbaI,EcoRI雙酶切,T4DNA連接酶將CXCR4基因連人pCDHl-MCS-EFl-copGFP,作用16h.此連接載體質(zhì)粒命名為pCDHl-CXCR4-EFl-copGFP.
          5.pCDHl-CXCR4-EF1-copGFP慢病毒載體質(zhì)粒鑒定:取5閃連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DHSa感受態(tài)細(xì)菌,恒溫箱370C培養(yǎng)14h,取單菌落370C,180、擴(kuò)增14h,提取質(zhì)粒,采用XbaI,EcoRI雙酶切鑒定,并測序鑒定.
          6.HEK293T細(xì)胞和Hela細(xì)胞培養(yǎng):2種細(xì)胞均在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)基中加100U/ml青霉素,100.可L鏈霉素,10%胎牛血清(FBS),培養(yǎng)箱條件為370C,5%的COz.
          7第3代4質(zhì)粒系統(tǒng)慢病毒顆粒包裝:將pRsv-Rev、pMDLG/pRRE、pVSV一G和pCDHl-CXCR4-EFl-copGFP4質(zhì)粒按照1:4:1:1的比例,采用PEI轉(zhuǎn)染法,PEI4倍體積,質(zhì)粒1倍體積室溫混勻,靜置10min,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,8h后換液,60h收集上清,離心2500r,5min,吸上清,0.45p.m的濾網(wǎng)過濾到50ml離心管中,超速離心40C,32000r,90min,棄上清,加雙無培養(yǎng)基4℃過夜重懸分裝,放置于一80℃保存.
          分別取0,1,2,4,8閃病毒感染Hela細(xì)胞(1x105個),各3個復(fù)孔24h后換液,繼續(xù)37℃培養(yǎng)至48h,倒置相差顯微鏡觀察熒光.
          8慢病毒顆粒滴度測定:按照流式細(xì)胞儀(BDFACSCalibur)要求處理細(xì)胞,鋪24孔板Hela細(xì)胞,每孔細(xì)胞1x105個,DMEM500},l,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h然后從80℃冰箱每種病毒取2管超離的病毒按n}}閃/4x,1/8X1/16閃感染.感染前24孔板換液,X00閃D'1IE}}I(含40m彭L的二乙胺基乙基右旋糖昔),37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,各組設(shè)對照組及3個復(fù)孔.慢病毒顆粒感染Hela細(xì)胞24h第3天)換液,然后繼續(xù)37℃培養(yǎng)至48h二感染后48h,按照流式細(xì)胞儀要求處理細(xì)胞,處理完細(xì)胞后通過流式細(xì)胞儀FL1通道測定綠色熒光,并根據(jù)結(jié)果計算病毒滴度TCID50/ml.
          9.實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timePCR)檢測Hela細(xì)胞表達(dá)大鼠CXCR4mRNA水平:取感染表達(dá)CXCR4基因慢病毒顆粒72h的Hela細(xì)胞(Hela-CXCR4)及傳5代之后的Hela-CXCR4分別5x106個,磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮,離心沉淀后加1mlTrizol,劇烈振蕩以裂解細(xì)胞,提取總RNA并行RT-PCR,得到的PCR產(chǎn)物作為模板L4·,行Real-timePCR,引物分別為:甘油醛_3_磷酸脫氫酶(GAPDH):上游5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3',下游5'-TGGT-GAAGACGCCAGTGGA-3';CXCR4:上游5'-CATCT-TCTTGACTGGCATAGTGGGC-3’,下游5’-CTGCTGTA-AAGGTTGACGGTGTAG-3'.反應(yīng)體系條件如下:第1步:95℃,5min,l個循環(huán).第2步:95℃,30s;56℃,30s;720C30s;40個循環(huán).第3步:720C,2min,1個循環(huán).
          10.Transwell小室觀察細(xì)胞遷移:小室的直徑為6.5mm,小室孔徑為85Nm分別將Hela細(xì)胞和Hela-CXCR4細(xì)胞置于小室上層,數(shù)量為1x10)個上層培養(yǎng)基為100閃,下層為600閃(分lJ}{加SDF'-1a0,50,100p,g/1.),細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5h,上層未遷移到下層的細(xì)胞棉簽擦掉,下層細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定30min,結(jié)晶紫染色20min、在顯微鏡下分另}}取5個視野計數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)量.
         

          結(jié)果
          1.CXCR4基因的獲得:以.D\1文庫為模飯經(jīng)過PCR獲得CXCR4基因,通過瓊脂糖凝膠電泳,獲得1050hp的條帶,成功獲得CXCR4基因(圖1).
          2.構(gòu)建pCDHI-CXCR4-EFl-copGFP慢病毒載體質(zhì)粒:經(jīng)連接后轉(zhuǎn)化DH5.感受態(tài)大腸桿菌,取單菌落,提取質(zhì)粒.采用XbaI,EcoRI雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)2條帶分別為7544by和1050by,條帶大小均正確(圖2),測序顯示構(gòu)建pCDHl-CXCR4-FF1-copGFP慢病毒載體質(zhì)粒成功.
          3.成功包裝第3代慢病毒顆粒:采用prl轉(zhuǎn)染法,用第3代慢病毒4質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝出慢病毒顆粒一并感勢Vela細(xì)胞72h以及傳5代之后,分別在倒置相差顯微鏡下觀察到強(qiáng)綠色熒光蛋白的表達(dá).
          4.流式細(xì)胞儀慢病毒滴度測定:以0閃病毒組作為陰性對照,通過流式細(xì)胞儀測定發(fā)熒光細(xì)胞比例,通過軟件分析得病毒滴度為7.89x10'TCID50/ml.
          5.Real-timePCR檢測Hela細(xì)胞表達(dá)大鼠CXCR4mRNA水平:通過Real-timePCR檢測,Hela細(xì)胞感染高表達(dá)CXCR4慢病毒顆粒72h與14d之后,持續(xù)高表達(dá)大鼠CXCR4蛋白的Hela細(xì)胞分別為空白載體對照組表達(dá)CXCR4mRNA的78.29,58.93倍.
          6.Transwell小室觀察細(xì)胞遷移:為了觀察Hela-CXCR4細(xì)胞遷移情況,本實驗分別用不同的SDF-1.濃度置于小室下層,Hela-CXCR4細(xì)胞組比空載體慢病毒感染Hela細(xì)胞(Hela-CDHl)組遷移數(shù)目多,并且觀察到隨著SDF-1.濃度的升高,遷移的細(xì)胞數(shù)目也越多二通過CXCR4特異性抑制劑AMD3100加人小室下層后觀察到細(xì)胞遷移數(shù)量減少.
          討論
          我們使用第3代慢病毒體系,通過慢病毒載體持續(xù)高表達(dá)CXCR4基因,并通過Real-timePCR檢測mR\A水平表達(dá)明顯增高慢病毒載體是以人類免疫缺陷I病毒(HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體區(qū)jJ小一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達(dá)到持久性表達(dá).第3代慢病毒可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞,從而達(dá)到良好的的基因治療效果基因治療可以通過改造活細(xì)胞的遺傳物質(zhì)達(dá)到在基因水平上治療疾病的目的.細(xì)胞治療為人類疾病治療提供了一種新的治療手段,基因修飾的細(xì)胞治療已經(jīng)在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等等都有廣泛的研究但是細(xì)胞治療面臨的關(guān)鍵問題是:細(xì)胞存活、細(xì)胞靶向遷移的能力等sfi}
          持續(xù)高表達(dá)CXCR4白勺細(xì)胞對于趨化因子SDF-1cx有明顯的細(xì)胞靶向遷移能力,并有濃度依賴性.通過Transwell試驗檢測細(xì)胞是與SDF-1a/CXCR4軸有高度親和力,能相互結(jié)合而構(gòu)成的藕聯(lián)分子對,SDF-1cx/CXCR4軸特異結(jié)合是其生物學(xué)功能的分子基礎(chǔ),與細(xì)胞間信息傳遞、細(xì)胞遷移、介導(dǎo)免疫及炎性反應(yīng)、調(diào)控造血干細(xì)胞遷移及歸巢、器官發(fā)育等等均有著密切關(guān)系SDF-1a/CXCR4軸與細(xì)胞遷移關(guān)系密切,能夠促進(jìn)高表達(dá)CXCR4的細(xì)胞向高濃度SDF-1.區(qū)域遷移.
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