肝細胞核因子4α促進人臍帶間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化的研究

           我們在前期添加細胞因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞(HUMSCs)的條件下,后期轉(zhuǎn)染肝細胞核因子4a(Hl}'F'4a)并檢測誘導(dǎo)效果,尋找一種新的肝細胞種子來源.
          一、材料與方法
          1.材料:臍帶由南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院婦產(chǎn)科提供.
          2.真核表達載體的構(gòu)建:設(shè)計可以擴增HNF4.全長的引物,上游引物為5’-AGGATCCATGCGACTCTCC.AAAACCC-TCG-3',下游引物為5'-AGAATTCCC'I'-AGATAACTTCCTGCTTGGTG-3’.
          3.HUMSCs的分離、培養(yǎng):采用組織塊培養(yǎng)法獲取原代HUMSCs.細胞達80%左右融合時用0.25%胰酶消化,按1:3比例傳代培養(yǎng).
          4.HUMSCs向肝細胞方向分化誘導(dǎo)方法:用含10歲L堿性成纖維細胞生長因子(bFGF),20,留LHGF的IMDM誘導(dǎo)9d,3--4d換液1次.然后采用陽離子脂質(zhì)體法將質(zhì)粒PCD\As.1}HVF4a轉(zhuǎn)染到HI}l"C*中(實驗組),對照組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒PCD\A3.1
          5.實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR):取末誘導(dǎo)、誘導(dǎo)9d、誘導(dǎo)21d實驗組和對照組細胞,相關(guān)操作按說明書進行
          6.免疫熒光法:取誘導(dǎo)21d的實驗組和對照組細胞,相關(guān)操作按說明書進行.
          7.統(tǒng)計學方法:結(jié)果以均數(shù)士標準差表示,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析.
          二、結(jié)果 1.形態(tài)學改變:轉(zhuǎn)染HNF4.后5d,細胞開始聚集成團,12d后細胞由梭形變?yōu)閳A形或類圓形對照組細胞仍為纖維母細胞樣.
          2.免疫熒光檢測結(jié)果:結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組細胞白蛋白(ALB)表達顯著,而甲胎蛋白(AFP)表達極弱.對照組細胞內(nèi)ALB基本不表達,但是表達一定的AFP.
          3.肝細胞特異性基因的表達:結(jié)果顯示添加細胞因子上調(diào)了基因ALB,酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)及葡萄糖6-磷酸酶(G-6P)的表達,對照組細胞繼續(xù)培養(yǎng)12d后ALB,TAT、細胞色素P450酶3A4(CYP3A4)及G-6P表達量較前有所增高(P<0.05),而實驗組同等基因的表達量顯著增高(P<0.O5).
          三、討論 HNF4.是核激素受體超家族的一員,對于維持肝細胞表型、肝細胞分化以及肝細胞結(jié)構(gòu)都發(fā)揮重要作用.本實驗形態(tài)學結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染HNF4a的實驗組與對照組比較,細胞更具有肝細胞樣特征,呈圓形、類圓形或多邊形,轉(zhuǎn)染12d后尤為明顯免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染12d后,ALB作為肝細胞分化成熟的標志物,在實驗組細胞內(nèi)有較強表達,而對照組紅色熒光極弱.AFP作為肝細胞特異性標志,在幼稚肝細胞高表達,在成熟肝細胞低表達,兩組細胞內(nèi),可見實驗組AFP熒光信號極弱.因此,可以認為HNF4.促進了干細胞誘導(dǎo)分化并獲得了成熟的表型.RT-qPCR結(jié)果顯示,盡管轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒12d后(對照組)特異性基因ALB,TAT,CYP3A4及G-6P的表達較前有所增高,但實驗組與對照組的差異有統(tǒng)計學意義,表明HNF4.通過對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有效促進了HLMSCs向肝細胞的分化.
          參考文獻 
          Watt AJ,Ganison WD,Duncan SA. HNF4:a central regulator of hepatocyte differentiation and function[J].Hepatology,2003.1249-1253.
          Parviz F,Matullo C,Garrison WD. Hepatocyte nuclear factor 4alpha controls the development of a hepatic epithelium and liver morphogenesis[J].Nature Genetics,2003.292-296.