法舒地爾可減輕野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓

         肺動(dòng)脈高壓是常見心血管疾病之一,其王要病理生理學(xué)特征是肺血_管阻力進(jìn)行性升高,并逐漸引起右心衰竭甚至死亡,肺動(dòng)脈高壓具有病囚復(fù)雜、發(fā)病率高、誤診率高、危害性強(qiáng)的特征,早期診斷和藥物治療的機(jī)會(huì)喪失,多數(shù)患者會(huì)在2一3年內(nèi)死于心力衰竭,因此這一疾病有"心血管系統(tǒng)的惡性腫瘤"之稱二相關(guān)指南將肺動(dòng)脈高‘作為了肺高血壓疾病中除了肺靜脈高壓、混合性肺高壓外的又一大類疾病幾,盡管肺動(dòng)脈高壓肺血管形態(tài)改變已經(jīng)比較明確,但是血管重構(gòu)和血管反應(yīng)性增加的機(jī)制仍然未完全闡明)對(duì)其發(fā)生機(jī)制的進(jìn)一步理解將有一助于為預(yù)防和治療肺動(dòng)脈高)}于以及肺高血壓提供臨床依據(jù).
Rho/Rlo激酶信號(hào)通路是體內(nèi)普遍存在的一條信號(hào)通路,Rh.被稱為小(}蛋自超家族,具有GTF酶活性、Rho激酶又稱Rh.相關(guān)激酶(ROCK),屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶.可與GTPRho相結(jié)合,是口前功能研究為洋細(xì)的Rh.下游靶效應(yīng)分子,它包括2種亞型.即ROCK-1和POCK-2,其中ROCK-1在心8L卜肺臟、骨骼肌、’腎臟和胰表達(dá)水平很高4_法舒地爾是一種新型異峰琳磺胺衍生物,通過阻斷Rh.激酶的活性,抑制肌球蛋白軒鏈激酶(TL等多個(gè)蛋白酶,進(jìn)而抑制血管平滑肌收縮終階段肌球蛋白輕鏈(M1,C)磷酸化,達(dá)到擴(kuò)張血管的作用.
         本研究選擇野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型,Rl,o激酶選擇性抑制劑法舒地爾對(duì)肺動(dòng)脈高床及肺朋曹重構(gòu)進(jìn)行書預(yù)治療6,進(jìn)一步探討B(tài)ho/fLl1Ch潔號(hào)傳導(dǎo)通路在肺動(dòng)脈高壓分子機(jī)制中的作用,以期為肺動(dòng)脈高版的臨床藥物治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).
         材料與方法 
         1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)健康`}:n<}gue-Dawlea(SD)雄性大鼠5E1只.8周齡,}本質(zhì)量300一350g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司).
         2.儀器:聚乙烯右心導(dǎo)管(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)顯微鏡(Oly}mpusimt221,日本)EPS-601電泳儀(Phamacia公司,瑞典).半干電轉(zhuǎn)儀TE70(}lmcrsham公司,瑞典丸垂直電泳槽SE?50(Hoofer公司,美國)BM-6240B/C多導(dǎo)電生理記錄儀(h丈都儀器1})電子天平(BP310S型,德國)}DS-C1電泳儀系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)(}mer}hamPharmaci.公司,瑞典).
         3.試劑:野百合堿(}1g1Tla公司,美國)鹽酸法舒地爾注射液(日本旭化成制藥株式會(huì)社,進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào):H20050331,產(chǎn)品批號(hào):ERS11MM)小鼠抗人Bh.相關(guān)激酶-1單克隆抗體(SantaCruz公司,美國)、兔源MYP'1'-1多克隆抗體(CST公司,美國)兔源pM}'I'T-州Thr853)多克隆抗體(CST公司,美國)BT試齊d盒為(PromegaCorporation,美國)TBTzoI試劑(Invitrogen,美國).
         4.動(dòng)物模型的建立、分組及其十預(yù):健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為正常對(duì)照4周組(N4組,;;=8)、模型對(duì)照4周組(X14組,,,=8)、正常對(duì)照8周組(1}8組,,*=8)、模型對(duì)照8周組(1}M8組,,,=16)和法舒地爾8周組(F8組,n=16)5組肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的建立將野百合堿濟(jì)解于1mol/L稀鹽酸溶液,以1mol/L氫氧化鈉溶液滴定至pH7.2,用生理鹽水配制成1%溶液,一次性于大鼠頭頸部皮下注身J‘野百合堿50m};/kg,4周后右心導(dǎo)管測(cè)壓方法檢測(cè)模刑是否建立成功,即M4組、4,18組皮下注射等體積生理鹽水,普通飼料分籠喂養(yǎng),自由飲水、進(jìn)食V18組同期腹腔注射等體積生理鹽水處理至第8周末F8組于造模成功后即第4周末開始腹腔注射法舒地爾15mg·k·d至第8周末.
         5.右心室收縮壓(RV'SP)和平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)的測(cè)定:于注射野百合堿后第4,8周末分別停藥2d(即經(jīng)過5個(gè)半衰期以土)然后以10plc水合氯醛30ml/k};腹腔內(nèi)注射麻醉,參照孫波和劉文利7的右心導(dǎo)管測(cè)仄方法經(jīng)右頸外靜脈插管至右心室和肺動(dòng)脈,肝素化后用多導(dǎo)電生理記錄儀測(cè)定RVSP和mPAP.
         6.組織學(xué)觀察:取大鼠心臟去心房及大血管,游離右心室(RV)和左心室加室間隔(LV+S),生理鹽水沖洗掉血液,用濾紙吸去表面水分,分別用電子天平稱重.并計(jì)算右心肥厚指數(shù),即RV/(LV+s)迅速在相同部位取肺組織置于4仁C0.1r}二乙基焦磷酞胺(DEPC)水中,置人液氮中速凍備提取蛋白10%中性福爾馬林溶液中固定48h,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片,備用于HE染色和免疫組化選取10個(gè)視野測(cè)定與呼吸性細(xì)支氣管及肺泡管伴行的直徑75一150},m的肺小動(dòng)脈管壁厚度占血管外徑的百分比(}Tl`Tr}c)和管壁面積占血管總山積的百分比(WA}7c).
         7.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷肺組織中的RocK-1蛋自表達(dá):參照福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行.用高壓熱修復(fù)方法,一抗?jié)舛?小鼠抗人P}ocK-1單克隆抗體(稀釋度1:100);何個(gè)視野測(cè)定一定而積內(nèi)陽性信號(hào)面積和陽性信號(hào)平均灰度,取均值后計(jì)算抗原陽}h}信號(hào)指數(shù)計(jì)算公式:陽性信號(hào)指數(shù)=信號(hào)面積X陽性信號(hào)平均灰度/測(cè)定面積Xloo_半定量的結(jié)果以陽性信號(hào)指數(shù)表.
         8.半定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(PST-PC1刊檢測(cè)肺組織ROCK-1mRNA表達(dá):參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司,美國)說明書進(jìn)行,cDNA鏈合成,反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min,94℃變性30s.52℃退火40s,72℃延伸30s,后72℃延伸7min,共30個(gè)循環(huán)二引物合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成Pock-1引物序列:擴(kuò)增產(chǎn)物大小為201by,上游引物5'-GGAAACGCTCC(;:A(;AC;ACTG-3',下游引物5'-CTGCGATTTGCTGA:1GGT_1AG-3’內(nèi)參照GAPDH引物序列:打一增產(chǎn)物大小為131帥.上游引物5'-GT(:CATGCCAT(:
         A(:TGC(::\C-3',下游引物5'-ATGACCTTGCCCACAGCCTT-3’各取PCR產(chǎn)物5閃,經(jīng)1.50}c瓊脂糖凝膠電泳,澳化乙錠染色,應(yīng)用Tmagenrastery)SCI.對(duì)凝膠成像,計(jì)算PCR產(chǎn)物電泳條帶灰度積分,并以(}APDH的灰度積分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校對(duì)口標(biāo)墓因P(}R產(chǎn)物的相對(duì)量=口標(biāo)墓因電泳條帶灰度積分/GAPDH電冰條'}I}灰度積分.
         9.大鼠肺組織胞漿蛋白質(zhì)提取及免疫印跡(V一estcrnblot)半定量分析檢測(cè)ROCK-1,MYPT-1及pMYPT-I蛋白表達(dá):肺組織胞漿蛋白的提取,按南京凱基抽提試劑盒說明書操作,Bradford法進(jìn)行定量,SDI-PAGF電泳,P\DF車專膜,一抗用TBST封閉脫色搖床后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)_化學(xué)發(fā)光,顯影,定影,將膠片進(jìn)行拍照,顯影圖像采用Bandscan生物醫(yī)學(xué)軟件分析處理,檢測(cè)ROCK-l(160000)和內(nèi)參p-actin(43000),M}"PT-1(140000)和pMYPT-1(160000)口標(biāo)帶的灰度值,分別以二者比值作半定量分析.
         10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料用x1、表示,符合正態(tài)分布的資料多組間均數(shù)比較采用方差分析,組間兩兩比較用LsD(方差齊)或Dunnett'sT3(方差不齊)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)以P<0.O5為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
         結(jié)果
         1.各組大鼠的一般情況分析:實(shí)驗(yàn)大鼠于注射野百合堿后第3周末逐漸出現(xiàn)進(jìn)食量減少,體質(zhì)量下降,毛發(fā)枯糙,活動(dòng)減少,喘C}C.、聲明顯等癥狀,至第8周末史為嚴(yán)重,甚至出現(xiàn)了嚴(yán)重右心衰竭和死亡F8組大鼠一般情況明顯優(yōu)于M8組,死亡動(dòng)物比例亦較低二實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),56只SI>大鼠中41只存活,其中\(zhòng)4組、1}}T4組和N8組每組的8只大鼠均存活,}}T8組存活5只(5/16),h8組存活12只(12/16)(圖1)實(shí)驗(yàn)開始后第4,8周末測(cè)壓后處死大鼠,}T4和1}R8組大鼠可見心包積液,偶見胸腔、腹腔積液,出現(xiàn)肝臟癖血點(diǎn)、月十腫大,肺部組織(尤其左肺中、下葉)可見肺部癖斑、癖血,出現(xiàn)肺水腫和纖維樣變.
         2.各組大鼠血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及右心肥厚指數(shù)檢測(cè)結(jié)果(表1);野百合堿注射后4周末`14組大鼠RVSP,mPAP顯著高于N4組(P均<0.O1),示肺動(dòng)脈高壓模型建立成功實(shí)驗(yàn)開始第4周末,M4組大鼠RV/(LV+S)顯著高于N4組(P<0.O5)一實(shí)驗(yàn)開始第8周末,V18組大鼠R}SP,mP-1P,liV(L}'+S)均進(jìn)一步高于114組(P均<0.05)F8組大鼠RVSP,mPAP雖仍高于\8組水平(P均<0.O5),但均顯著低于M8組(P均<0.O5),F8組大鼠PTV/(LV十S)亦顯著低于M8組(P<0.05,且與N8組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
         3.各組大鼠肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(表2):N4組、}r8組大鼠肺小動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù),分布均勻,大小厚薄較一致,血管壁無增厚,血管腔無狹窄至實(shí)驗(yàn)開始第4周末M4組大鼠肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性差,層平滑肌細(xì)胞肥大、排列紊亂,血管腔明顯狹窄,T%和A%均明顯高于1V'4組(P均<0.05),M8組則進(jìn)一步高于M4組(P<0.01)F8組大鼠病變較輕,U;,T%和VA%均明顯低于'VI8組(P均<0.O1).
         4.各組大鼠肺組織中ROCK-1蛋白表達(dá)水平的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(圖2);ROCK-1陽性表達(dá)產(chǎn)物以棕色反應(yīng)物為表現(xiàn),棕色反應(yīng)物廣泛位于肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和一些支氣管及肺泡上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)開始第4周末.M4組大鼠肺組織中ROCK-1蛋日表達(dá)水平({掃性信號(hào)指數(shù):17.51士0.2W明顯0于\4組(陽性信號(hào)指數(shù):7.24士0.13)(P<0.01>提T經(jīng)野百合堿誘導(dǎo)后的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型成功建立.同樣,實(shí)驗(yàn)開始第8周末,M8組大鼠肺組織中ROCK-1蛋白表達(dá)水平(陽性信號(hào)指數(shù):20.68士0.27)亦明顯高于N8組(陽性信號(hào)指數(shù):8.1910.09)(P<0.01),且'}M8組進(jìn)一步高于}I4組(P<0.05)法舒地爾治療4周后,F8組大鼠肺組織中ROCK-1蛋白表達(dá)水平(陽性信號(hào)指數(shù):12.35士0.08)明顯低于M8組(P<0.01),但仍較\8組高(P<0.O5).
        

         5.各組大鼠肺組織中R(>(:K-1mRNA表達(dá)的RT-P(:R檢測(cè)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)開始第4,8周末,\}4組和N8組大鼠肺組織中ROCK-1mRNA表達(dá)較少(RT-PCR的相對(duì)一表達(dá)量分別為1.1081士0.2011和1.070810.1931),M4組(RT-PCR的相對(duì)表達(dá)量為1.6132士0.1541)則顯著高于V'4組(P<0.01).F8組大鼠肺組織中ROCK-1mRNA的表達(dá)水平(RT_PCR相對(duì)量為1.2139士0.1778)顯著低于M8組(RT-PCR相對(duì)量為1.6839士0.3251)(P<0.01).
         6.各組大鼠肺組織中ROCK-1蛋白表達(dá)水平及M}'P1'-1蛋白磷酸化程度的Westernblot檢測(cè)結(jié)果(圖3,4,表3):灰度分析結(jié)果TM4組和M8組大鼠肺組織中ROCK-1蛋白表達(dá)水平均明顯高于N4組(P均<0.01),M4組與M8組間差異尤統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.F8組大鼠肺組織中hocT<-}蛋白表達(dá)水平則明顯低于M8組(P<0.01),但仍較118組高(P<0.O5卜M14,M8組大鼠肺組織中RMYPT-1蛋白磷酸化程度明顯高于N4組(P<0.01),M8組與I}'T4組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,F8組MYPT-1蛋白磷酸化程度則明顯低于M4和1}}18組(P均<0.01,但仍高于N8}N.(p<0.05).
         討論
         有研究發(fā)現(xiàn)野百合堿可引起肺血管內(nèi)膜損傷及肺血管重構(gòu),而形成肺動(dòng)脈高壓,與人類肺動(dòng)脈高不的發(fā)病過程中,血管收縮、舒張因子失衡,血管收縮及個(gè)同程度肺血管亞構(gòu)和肺而_管阻力增加的病理機(jī)制相似,故野百合堿引起的肺動(dòng)脈高壓大鼠是一種較為理想和市用的動(dòng)物模},}-y-io+_本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了此結(jié)淪,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯不子以大鼠皮下一次性注身J一野百合堿(50mg/kg),3周后大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量增{封y、毛發(fā)色澤灰暗、喘L.、聲粗等表現(xiàn),4周后即可弓{起典型的肺動(dòng)詠高壓表現(xiàn)為RVSP,mPr'P顯著升高,繼發(fā)右心室肥厚,至第8周末R}'SP,mPAP進(jìn)一步升高,目_有淬死發(fā)生.解劑后發(fā)現(xiàn)胸腔、腹腔甚至心包積液,肝癖血,肺癖點(diǎn)、癖斑,短軸橫切心臟發(fā)現(xiàn)右心室肥厚明顯,提示實(shí)驗(yàn)大鼠發(fā)生右心衰竭二我們認(rèn)為一次性注射野百合堿(50mg/k幻誘導(dǎo)4周的大鼠是一種敏感性高、生存率高、成本低、重復(fù)性好的肺功脈高壓動(dòng)物模型本研究發(fā)現(xiàn),野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠R()(二K一]蛋}}I表達(dá)明顯增多,且多于肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá),肺小動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增生,血管中膜明顯增厚,管腔狹窄,而法舒地爾治療可使模型大鼠ROCK-1蛋白表達(dá)水平下降,明顯降低RVSP,mP_}1P及減軒右心室肥厚肺動(dòng)脈高壓形成過程中,Rho/Rl-,o激酶通路的激活與肺血管的收縮和重構(gòu)關(guān)系密切Rho/ROCK信號(hào)通路的關(guān)鍵分子包括Rho,GTP酶,Rh.相關(guān)激酶(ROCK)和肌球蛋自磷酸酶等當(dāng)Rh<,蛋白與GTP結(jié)合時(shí)呈激話狀態(tài),從而發(fā)生多個(gè)氨基酸位點(diǎn)磷酸化而激活,并介導(dǎo)下游一系列磷酸化/月兌磷酸化反應(yīng),引起細(xì)胞收縮、游走私附、生長分裂、應(yīng)力纖維產(chǎn)生及平滑肌運(yùn)動(dòng)、膠原合成等生物效應(yīng).
         本研究觀察了法舒地爾對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響,結(jié)果顯示大鼠肺組織中ROCK-1蛋I}1表達(dá)水平在野百合堿誘導(dǎo)后4周即明顯升高,提示ROCK-1在肺動(dòng)脈高形成過程中具有重要作用法舒地爾能通過抑制RO(:K-1活睦,平衡內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌L;'T'-1,}O水平,從而增強(qiáng)內(nèi)皮介導(dǎo)的血管重構(gòu)效應(yīng),改善肺動(dòng)脈高)f癥狀肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASYIC)表型由收縮烈同合成型轉(zhuǎn)變、增生和肥大是肺血管重構(gòu)的主要病理特征,同時(shí)伴有遠(yuǎn)端非肌性11ii_管肌化淵節(jié)bMI,C的磷酸化和去磷酸化是ROCK調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞收縮的主要機(jī)制M1,C被鈣調(diào)蛋白激活的MI,CK磷酸化,被不依賴Ca-+的MT.CP去磷酸化_MLCP是口前研究得多也是清楚的Rho激酶作用的底物之一’3-3m_ROCK的激活,d一以進(jìn)一步磷酸化MYPT-1(MLCP的調(diào)節(jié)亞單位),抑制MT,CP的活性細(xì)胞漿內(nèi)Ca-+濃度的升高通過激活M上CK和隨后的11}1T.C磷酸化引起平滑肌細(xì)抱收縮因此.
         MYPT-1磷酸化水平還可以反映P}}}IC日訓(xùn)‘(縮程度5」P;W-TC的收縮、重構(gòu),使肺動(dòng)脈!}一力上升、石心室后負(fù)荷過重,可導(dǎo)致右心室肥厚,甚至右心衰竭和死亡因此,法舒地爾可通過抑制ROCK-1活性,改善肺血管重構(gòu)及緩解平滑肌細(xì)胞收縮,從而減輕野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓本研究觀察了Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路在師動(dòng)脈高壓形成中的表達(dá)與激活規(guī)律進(jìn)一步探討了Rho激酶卜游信號(hào)分子—MYPT-1蛋白磷酸化程度的改變對(duì)肺動(dòng)脈血管收縮的影響本研究發(fā)現(xiàn)法舒地爾能有效地抑制ROCK-1活性,降低肺動(dòng)脈壓力,改善肺血管持續(xù)收縮,為肺動(dòng)脈高壓的藥物治療提供了新的研究方}句當(dāng)前,Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路及其上下游信號(hào)分子的縱向研究已成為肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的研究熱}'a,而此通路的!_下游信號(hào)之間是否存在橫同的相互調(diào)節(jié)、反饋,可能會(huì)成為今后肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的研究方向之一.
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