全反式維甲酸誘導(dǎo)分化腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞治療膠質(zhì)瘤的實驗研究

    膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤，尤以多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度高，患者的中位生存時間仍不到15個月。神經(jīng)干細(xì)胞能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡;神經(jīng)干細(xì)胞能向膠質(zhì)瘤遷移并將其包繞，可作為載體攜帶抗腫瘤分子實現(xiàn)抑制或殺死腫瘤細(xì)胞的作用，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長或誘導(dǎo)其凋亡[2-4]。筆者通過實驗分析了全反式維甲酸對大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用及其機制，現(xiàn)報告如下。
 

    1材料與方法

    1.1實驗材料：美國Hyclone公司的DMEM培養(yǎng)基、DMEM /F-12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、加拿大STEMCELL TECHNOLOGIES 公司的血清替代劑BIT。人神經(jīng)干細(xì)胞(Rencell CX immortalized cells，SCC007)購買自Millipore公司，按說明手冊培養(yǎng);C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞所;原代膠質(zhì)瘤干細(xì)胞來自人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本富集培養(yǎng)。

    1.2 實驗方法：將培養(yǎng)細(xì)胞分成兩組：①全反式維甲酸組：含血清培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基)中力H.X終濃度為10 nmol/L的全反式維甲酸;②對照組：含血清培養(yǎng)基中含有與ATRA組等量的DMSO(終濃度<0.01%)。實驗方法主要為C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)，選擇生長狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)00.1%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液或直接將腫瘤細(xì)胞球用PBS液清洗，分別重懸于以上不同培養(yǎng)基中，置3 7℃，5%CO.2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，顯微鏡下觀察。采用MRI檢測膠質(zhì)瘤的體積變化、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖時相變化及免疫組化檢測p27Kipl蛋白的變化。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法：采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 18.00進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相關(guān)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x〖TX-*3〗±s)表示，組間比較采用單因素方差分析、LSD法、t分析、 χ.2檢驗等，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
 

    2結(jié)果
 

    2.1腫瘤體積變化：顯微鏡下觀察到C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)后6 h后均貼壁，1 d即開始分化增殖;相鄰細(xì)胞間突起相互連接成網(wǎng)狀。同時全反式維甲酸組的腫瘤球分化趨勢更明顯，細(xì)胞大小不一，形態(tài)各異。對照組的腫瘤分化趨勢無明顯變化，同時全反式維甲酸組較對照組腫瘤體積明顯減小[(33.23±7.34)cm 3和(41.43±6.98)cm.3,P<0.05]。

    2.2 細(xì)胞周期的變化：經(jīng)過觀察，全反式維甲酸組的 G0期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05)，S期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05)。

23p27Kipl蛋白的變化：經(jīng)過觀察，在誘導(dǎo)分化培養(yǎng) 24 h后，兩組細(xì)胞p27Kipl的蛋白分泌水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);多重比較，全反式維甲酸組分泌水平顯著高于對照組(0.76±0.21和0.52±0.25,P<0.05)。 

    3討論惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤之一，具有浸潤性生長、易復(fù)發(fā)和播散轉(zhuǎn)移的特點，是目前神經(jīng)外科的治療難點。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，與腫瘤的發(fā)生和生長密切相關(guān)。調(diào)查顯示，神經(jīng)干細(xì)胞具有向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的特性，神經(jīng)干細(xì)胞固有的定向遷移特性不僅可以發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤生長作用，還可作為特定基因的載體發(fā)揮靶向治療作用。同時膠質(zhì)瘤干細(xì)胞于體外神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)條件下形成細(xì)胞球，呈懸浮球樣生長;腫瘤細(xì)胞多處于Go期，在刺激信號的作用下可以進(jìn)入細(xì)胞周期以對稱和(或)不對稱方式進(jìn)行分裂增殖;能夠多向分化成為各種腫瘤表型細(xì)胞，接種至免疫缺陷動物后能夠致瘤;具有自我更新和無限增殖能力;具有較強的遷徙能力以及對放射治療或藥物化療的耐受。體內(nèi)研究證實神經(jīng)干細(xì)胞具有向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的能力，并將腫瘤包繞，向腫瘤遷移的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量越多，形成的腫瘤體積越小。體外干細(xì)胞條件下神經(jīng)球培養(yǎng)法可成功獲得高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志、具有自我更新能力和多向分化潛能的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。全反式維甲酸是當(dāng)前研究比較深入、作用強的誘導(dǎo)分化劑之一，對腫瘤細(xì)胞增殖抑制途徑廣泛。當(dāng)前我國大約有60%的白血病患者經(jīng)過以全反式維甲酸為主的治療后得到明顯緩解和治愈。同時全反式維甲酸誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化的能力也得到了肯定，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸與紫杉醇聯(lián)合作用于接種了腫瘤細(xì)胞的移植瘤裸鼠能誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡，使腫瘤縮小。為此膠質(zhì)瘤干細(xì)胞較其分化細(xì)胞對神經(jīng)干細(xì)胞遷移更具趨化能力，并且與其分泌高水平的生長因子有關(guān)。也有學(xué)者認(rèn)為全反式維甲酸可有效誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化，降低膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表型;可抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞Notch 信號通路，提示可作為靶向治療膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的措施。本組資料中全反式維甲酸組較對照組腫瘤體積明顯減小(P<0.05);Go期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05)，S期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05)。有研究證實腫瘤干細(xì)胞通過分泌大量的p27Kipl蛋白促進(jìn)腫瘤血管生成，對腫瘤生長和侵襲起到了決定性作用，全反式維甲酸組的p27Kipl蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。總之，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系自身具有一定的干細(xì)胞特性，全反式維甲酸通過上調(diào)p27Kipl蛋白的表達(dá)而抑制大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。
 

    4參考文獻(xiàn)

    [1]楊轉(zhuǎn)移,鄧永文,方加勝,等.U251源性腦腫瘤干細(xì)胞的耐藥性及耐藥酶的表達(dá)[J] .中國癌癥雜志,2009，2(10):889.
 

    [2]于春泳,魏學(xué)忠,薛洪利,等.人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和分化過程中NOTCH-1信號通路的調(diào)控[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,8(11):1853.
 

    [3]于如同,陳沖,石瓊,等.MDR1 shRNA對人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞多藥耐藥性實驗研究[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2008,4(18):494.
 

    [4]于春泳,尹昌林,呂勝青,等.NOTCH-1信號通路對人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和分化作用的研究[J].中國微侵襲神經(jīng)外科雜志,2008,16(8):268.
 

    收稿日期：2014-01-15編校：鄭英善]