下一代測(cè)序技術(shù)促進(jìn)罕見遺傳病的診治和咨詢

下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)是對(duì)傳統(tǒng)一代測(cè)序技術(shù)的革命性改變，該技術(shù)具有高通量和低單堿基成本的特點(diǎn)。全外顯子組測(cè)序自2009年用于罕見遺傳病分子病因?qū)W研究和診斷以來(lái)[1]，大大提高了分子診斷用于遺傳病患者的效率。目前臨床仍在不斷積累經(jīng)驗(yàn)以爭(zhēng)取大程度地發(fā)揮NGS在罕見遺傳病診斷中的功效，下面就診斷流程的幾個(gè)主要方面作簡(jiǎn)要討論。 一、遺傳性罕見病的臨床初步鑒別絕大多數(shù)罕見病有遺傳基礎(chǔ)，此外致病原因還包括感染、環(huán)境毒理、飲食及化學(xué)物暴露等非遺傳因素[2]。臨床上有效鑒別是否為遺傳性疾病，能提高NGS對(duì)罕見病的診斷率，從而間接降低醫(yī)療成本，提高臨床功效性。臨床醫(yī)生在鑒別時(shí)需要綜合考慮多種因素，包括對(duì)先證者的家族史、妊娠史、家庭社會(huì)生活環(huán)境的全面了解。
二、測(cè)試前的遺傳咨詢遺傳檢測(cè)是一項(xiàng)比較復(fù)雜的臨床檢測(cè)項(xiàng)目，患者及家屬需要專業(yè)人員為其提供遺傳咨詢。由于NGS檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)昂貴，項(xiàng)目種類也較多，且各有其優(yōu)勢(shì)和局限性，因此有必要進(jìn)行測(cè)試前的遺傳咨詢。通過(guò)遺傳咨詢使患者及家屬對(duì)檢測(cè)的預(yù)期結(jié)果有一定客觀的認(rèn)識(shí)，對(duì)可能產(chǎn)生的和檢測(cè)目的不相關(guān)的發(fā)現(xiàn)有知情選擇，并能充分了解檢測(cè)結(jié)果對(duì)家庭其他成員的潛在影響，咨詢還應(yīng)包括介紹此類測(cè)試的替代方案，以供患者及家屬選擇。目前對(duì)是否報(bào)道檢測(cè)目的外的基因變異意外發(fā)現(xiàn)還沒有統(tǒng)一的規(guī)定，這也是測(cè)試前咨詢的重要內(nèi)容[3]。
三、臨床表型信息的采集及標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)醫(yī)生收集完整、準(zhǔn)確的臨床表型信息是基因診斷的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，臨床外顯子組或全外顯子檢測(cè)結(jié)果分析在很大程度上依靠對(duì)基因型-表型相關(guān)性的了解，因此全面準(zhǔn)確地評(píng)估臨床表型并用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)描述記錄尤為重要。通過(guò)從遺傳疾病知識(shí)庫(kù)[如在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)，Orphanet，Pubmed等]中搜尋基因與疾病、表型與基因的相關(guān)性，從而能夠優(yōu)先考慮和臨床癥狀相關(guān)的基因的罕見功能性變異。為更好地描述臨床表型，美國(guó)形態(tài)學(xué)要素協(xié)作組對(duì)體表畸形術(shù)語(yǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化及含義作了定義，可以為臨床醫(yī)生描述畸形癥狀提供指導(dǎo)和依據(jù)。此外，國(guó)際人類表型標(biāo)準(zhǔn)用語(yǔ)聯(lián)盟(Human Phenotype Ontology，HPO)也對(duì)人類疾病異常表型的標(biāo)準(zhǔn)化術(shù)語(yǔ)進(jìn)行了規(guī)范化。目前HPO收錄了11 000個(gè)和異常表型對(duì)應(yīng)的詞條，并提供了系統(tǒng)的分類管理[4]。特別是對(duì)OMIM、Orphanet和DECIPHER中記錄的7 000多種罕見病及4 000多種常見病提供了HPO的注釋，中文版開放平臺(tái)的建立將對(duì)中文使用者的臨床和科研工作起到極大的推動(dòng)作用。
四、選擇恰當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法罕見遺傳病的病種很多，其突變種類也很多，不同的突變需要用不同的檢測(cè)手段。基于NGS的分子檢測(cè)可以根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的多少分成單基因、基因包、臨床外顯子、全外顯子組及全基因組的檢測(cè)[5]。在NGS時(shí)代，單基因的檢測(cè)仍然很有必要，在一些情況下是必須的，主要應(yīng)用于以下一些情況：(1)臨床能明確診斷、致病基因單一的疾病，如1型神經(jīng)纖維瘤；(2)致病基因的變異不能為NGS所檢測(cè)，常見的包括脆性X染色體FMR1基因中CGG的擴(kuò)增檢測(cè)，普瑞德威利-天使綜合征的甲基化分析等?；虬臋z測(cè)對(duì)臨床有特異表型但遺傳異質(zhì)性較強(qiáng)，需要作鑒別診斷的病種較為合適，其臨床功效也在很大程度上取決于臨床醫(yī)生對(duì)臨床診斷的把握度，也取決于已知致病基因能解釋這類疾病的比例。由于新基因不斷被發(fā)現(xiàn)，基因包也需不斷地更新。臨床外顯子名義上包含所有已知的致病基因，但實(shí)際上無(wú)法完全實(shí)現(xiàn)，因?yàn)橐皇切轮虏』虻陌l(fā)現(xiàn)速度很快，二是許多曾經(jīng)以為的致病基因事實(shí)上并不是或還沒有足夠的證據(jù)支持是明確的致病基因。全外顯子組理論上應(yīng)包含基因組的所有編碼區(qū)域，但實(shí)際上由于各公司產(chǎn)品設(shè)計(jì)不同、測(cè)序過(guò)程中一些區(qū)域覆蓋度不夠、某些基因區(qū)域存在同源序列等原因，導(dǎo)至全外顯子組測(cè)序無(wú)法對(duì)基因組的所有編碼區(qū)域進(jìn)行有效捕獲與測(cè)序。全基因組測(cè)序已經(jīng)開始常規(guī)用于拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)的分析，只需很低的覆蓋度(比如0.1X)就能檢測(cè)出全基因組范圍內(nèi)的CNV，檢測(cè)成本不超過(guò)目前一般的染色體芯片，但全基因組測(cè)序還沒有常規(guī)性用于序列變異的檢測(cè)，因?yàn)闄z測(cè)序列變異所要求的覆蓋度在30X，測(cè)序的成本較高。相信隨著新的測(cè)序技術(shù)的突破，終會(huì)將我們帶入全基因組測(cè)序的時(shí)代。
檢測(cè)先證者父母及其他家庭成員，對(duì)明確致病變異很有幫助。常見的是核心家系的檢測(cè)(父母加先證者，Trio)。當(dāng)該病癥被認(rèn)為可能是由于其中一個(gè)親本中的生殖細(xì)胞(精子或卵)突變而引起時(shí)，同時(shí)檢測(cè)父母非常有助于快速鑒定是否為新發(fā)變異。大多數(shù)嚴(yán)重影響個(gè)體生殖健康的高外顯性疾病往往是由于新發(fā)變異造成的，這在嚴(yán)重智力障礙和自閉癥譜系障礙等患者中已經(jīng)得到了充分證明。Trio檢測(cè)還可以確認(rèn)同一基因上不同變異的父母來(lái)源，從而確認(rèn)變異的順式或反式(復(fù)合雜合)的構(gòu)型，這對(duì)于評(píng)估隱性遺傳病特別重要。
五、測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控及數(shù)據(jù)有效性評(píng)估NGS應(yīng)用于臨床檢測(cè)必需經(jīng)過(guò)對(duì)檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)及檢測(cè)項(xiàng)目的優(yōu)化和驗(yàn)證，建立標(biāo)準(zhǔn)化流程和質(zhì)量保障措施，以保證檢測(cè)技術(shù)的有效性。在眾多數(shù)據(jù)質(zhì)量參數(shù)中，測(cè)序覆蓋度對(duì)變異檢出率有至關(guān)重要的影響。過(guò)低的測(cè)序覆蓋度會(huì)導(dǎo)至漏檢真正的變異，造成假陰性，另一方面也可能因不能有效過(guò)濾一些不真實(shí)的變異及界定不正確的合子狀態(tài)而導(dǎo)至假陽(yáng)性。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)技術(shù)指南[6]，如全外顯子組的測(cè)序，對(duì)于先證者標(biāo)本，要求90%～95%區(qū)域的平均測(cè)序覆蓋度應(yīng)達(dá)到100X，而Trio測(cè)序，70X即可達(dá)到低要求。
六、變異的臨床意義分析分析序列變異的臨床意義不是一個(gè)簡(jiǎn)單或直接的過(guò)程。過(guò)去所報(bào)告的致病變異可能并非真的致病性變異，因此變異的臨床意義分析應(yīng)基于新的證據(jù)。過(guò)去分析過(guò)的一些變異在一段時(shí)間后或有新的證據(jù)出現(xiàn)后需要進(jìn)行重新分析，因此變異的臨床解讀是一項(xiàng)持續(xù)性的工作。相同的變異在不同的評(píng)估原則下可能會(huì)呈現(xiàn)不同結(jié)果，ACMG/美國(guó)分子病理學(xué)學(xué)會(huì)(Association for Molecular Pathology，AMP)測(cè)序變異的致病性分析指南為我們制定了統(tǒng)一的原則，使得變異分析有規(guī)可循，但對(duì)原則的不同理解也仍然會(huì)導(dǎo)至不一致的結(jié)論[7]。此外，由于對(duì)疾病基因致病機(jī)制了解不夠充分，同一基因可能會(huì)以不同的變異方式導(dǎo)至不同疾病，共享人群數(shù)據(jù)庫(kù)中也缺乏足夠的中國(guó)人群參照數(shù)據(jù)，這些因素都增加了變異臨床意義分析的難度。對(duì)一個(gè)變異的分析有時(shí)需要花費(fèi)大量時(shí)間精力查找閱讀相關(guān)文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)，即便如此也不一定能得出比較肯定的結(jié)論，目前很大一部分的變異只能歸類為臨床意義不明。筆者認(rèn)為，對(duì)于沒有其他依據(jù)可循的變異，實(shí)驗(yàn)室有必要開展功能性研究，這是一項(xiàng)有待發(fā)展的重要方向。迄今，已知超過(guò)5 000個(gè)基因被發(fā)現(xiàn)與人類疾病相關(guān)，任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)室都無(wú)法做到對(duì)所有基因有充分的了解，因此實(shí)驗(yàn)室間共享經(jīng)驗(yàn)、共享變異分析的結(jié)果是非常必要的，這就催生了ClinGen的誕生。ClinGen旨在通過(guò)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室的合作，通過(guò)制定共識(shí)性原則的、臨床共享資源的集中開發(fā)，達(dá)到共贏的目的，終為患者提供更有效的服務(wù)[8]。
七、變異的臨床相關(guān)性分析及報(bào)告ACMG指南將序列變異的臨床意義分為五類：致病性(pathogenic，P)，可能致病性(likely pathogenic，LP)，臨床意義不明(uncertain significance，VUS)，可能良性(likely benign，LB)和良性(benign，B)[7]。報(bào)告變異內(nèi)容主要取決于以下幾個(gè)原則：(1)對(duì)于診斷性檢測(cè)，報(bào)告的變異應(yīng)該和患者的臨床表型有關(guān)聯(lián)，這就需要通過(guò)臨床相關(guān)性分析來(lái)決定，但臨床相關(guān)性分析還沒有一個(gè)定量的流程，主要看癥狀的吻合程度，除了要考慮相符的癥狀外，也要考量不相符的癥狀。一些不相符的癥狀在分析過(guò)濾變異時(shí)會(huì)被鑒別剔除。臨床相關(guān)性分析的另一個(gè)重要內(nèi)容是分析患者的所有癥狀是否都能被找到的變異所解釋。對(duì)于預(yù)測(cè)性檢測(cè)，比如產(chǎn)前檢測(cè)，我們需要制定共識(shí)性的原則，分析界定可報(bào)、不可報(bào)的基因/變異種類。(2)與本次檢測(cè)目的無(wú)關(guān)的、意外發(fā)現(xiàn)的變異是否納入報(bào)告取決于測(cè)試前遺傳咨詢結(jié)果，根據(jù)患者或家屬的選擇來(lái)決定。(3)一般良性和可能良性的變異不會(huì)被納入報(bào)告中。外顯子組臨床報(bào)告的內(nèi)容和格式已由ACMG實(shí)踐指南提出了建議，國(guó)內(nèi)有關(guān)組織也有建議[9]。臨床報(bào)告中重要的部分是提供支持變異分類的證據(jù)及證據(jù)的來(lái)源，并為送檢醫(yī)生及患者提供相關(guān)的建議。
八、遺傳咨詢是遺傳檢測(cè)不可缺少的重要環(huán)節(jié)，遺傳咨詢的對(duì)象包括送檢醫(yī)生、患者和家屬。我國(guó)尚無(wú)一套針對(duì)NGS檢測(cè)進(jìn)行遺傳咨詢的原則和操作規(guī)范，需要在實(shí)踐和研究中總結(jié)發(fā)展。筆者認(rèn)為，中國(guó)遺傳咨詢師的主要工作是為臨床醫(yī)生及患者就基因檢測(cè)報(bào)告提供針對(duì)性的詮釋及咨詢，包括分析明確遺傳模式、評(píng)估疾病或癥狀的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)以及生育的建議；解釋遺傳疾病的發(fā)病原因、疾病自然發(fā)展史、臨床表現(xiàn)與可能的干預(yù)和治療措施以及預(yù)后情況；結(jié)合心理評(píng)估識(shí)別患者及家屬在情感、社會(huì)、教育以及文化等方面的理解及接受問題；評(píng)估患者和(或)家庭成員對(duì)出現(xiàn)疾病或存在疾病再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的理解及反應(yīng)程度；充分了解并為患者及家屬提供有效的醫(yī)學(xué)、教育、經(jīng)濟(jì)以及心理等社會(huì)資源，包括權(quán)威性的信息源(書籍文獻(xiàn)網(wǎng)站等)、專家?guī)?、互助組織等信息；引導(dǎo)患者及家屬參與診斷及研究項(xiàng)目，提供知情同意的解釋。目前主要的任務(wù)是培養(yǎng)一批掌握基因組學(xué)知識(shí)，并具備一定臨床知識(shí)的遺傳咨詢師。
九、結(jié)語(yǔ)NGS為罕見病的早期確診提供了可靠的技術(shù)平臺(tái)，有助于患者盡早開展治療干預(yù)，達(dá)到改善預(yù)后、降低疾病嚴(yán)重性的目的。希望隨著臨床檢測(cè)質(zhì)量管理的加強(qiáng)，NGS能更規(guī)范化地應(yīng)用于臨床。