冷凍電鏡揭示RNA質(zhì)量控制背后的機(jī)制

細(xì)胞中的RNA質(zhì)量控制，如RNA的降解及RNA總量穩(wěn)定的調(diào)控，被細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)機(jī)器精確調(diào)控，比如被稱為細(xì)胞監(jiān)視器的RNA外切體（exosome)，RNA外切體激活子NEXT復(fù)合物（Nuclear exosome targeting complex），從而維持機(jī)體的正常生理功能。NEXT在剪切體上游行使功能，招募RNA外切體對(duì)新轉(zhuǎn)錄出來的RNA進(jìn)行降解。很長(zhǎng)一段時(shí)間里，結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段利用晶體學(xué)手段嘗試解析NEXT的結(jié)構(gòu)，以期了解NEXT調(diào)控RNA質(zhì)量穩(wěn)定的作用機(jī)制，但由于復(fù)雜的結(jié)構(gòu)組成和高度動(dòng)態(tài)的特征結(jié)構(gòu)解析一直未果。近日，冷凍電鏡讓NEXT復(fù)合物的結(jié)構(gòu)得以呈現(xiàn)，RNA質(zhì)量穩(wěn)定背后的詳細(xì)機(jī)制得以窺見。

  在生物學(xué)中，清理機(jī)體產(chǎn)生的“廢物”與制造物質(zhì)同等重要。生物體產(chǎn)生的不再需要的細(xì)胞、蛋白質(zhì)或其他分子的聚集，如不及時(shí)處理，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生一些問題。不過，生物已經(jīng)進(jìn)化了出多種方法來完成清理多余物質(zhì)的清理。   一個(gè)典型的例子是RNA外切體。RNA分子在細(xì)胞中扮演許多角色。其中一些被翻譯成蛋白質(zhì)，一些則與細(xì)胞的蛋白質(zhì)一起形成蛋白質(zhì)-RNA機(jī)器。RNA外切體是一種細(xì)胞機(jī)器，可以降解有缺陷、有害或不再需要的RNA分子。如果不依靠外切體進(jìn)行修剪，我們的細(xì)胞就會(huì)變成功能失調(diào)的囤積者，進(jìn)而無法正常行駛功能。   “RNA的監(jiān)測(cè)和降解途徑存在于所有形式的生命中，”斯隆凱特林研究所結(jié)構(gòu)生物學(xué)項(xiàng)目主席Christopher Lima解釋說。“從細(xì)菌到人類，所有生物都有監(jiān)測(cè)RNA的狀態(tài)并靶向降解RNA的機(jī)制。   Lima博士說，在很長(zhǎng)一段時(shí)間里，這些降解通路被認(rèn)為像家務(wù)一樣，是重復(fù)且枯燥的。但事實(shí)證明，這些降解通路受到高度調(diào)控，并控制著從胚胎發(fā)育到細(xì)胞周期的許多過程。   更重要的是，通路一旦發(fā)生失調(diào)，從癌癥到神經(jīng)系統(tǒng)退化的許多類型疾病便會(huì)產(chǎn)生。   

在2022年6月9日發(fā)表在Cell上的一篇新論文中，Lima博士和實(shí)驗(yàn)室的博士后研究員Puno提出了有助于解釋RNA外切體如何定位需要降解的RNA的研究結(jié)果。在冷凍電鏡的幫助下，科學(xué)家們解析了一種RNA降解機(jī)制   的關(guān)鍵部分   ，名為細(xì)胞核外切體靶向復(fù)合物（ Nuclear Exosome Targeting ，NEXT）的蛋白質(zhì)組裝體的結(jié)構(gòu)。     “我們知道NEXT將RNA靶向遞送到RNA外切體，但在生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)上，我們不知道它是什么樣子，也不知道它是如何工作的?！?  —Puno  結(jié)構(gòu)生物學(xué)家     現(xiàn)在，通過冷凍電鏡，科學(xué)家們獲得了獲得了NEXT與RNA結(jié)合的第一張清晰圖片。這些圖片及相關(guān)的生化和生物實(shí)驗(yàn)揭示了RNA分子被傳遞到RNA外切體并進(jìn)行降解的過程。       

01

逐漸了解結(jié)構(gòu)         幾年前，Puno博士開始使用當(dāng)時(shí)的金標(biāo)準(zhǔn)X射線晶體學(xué)方法研究NEXT的結(jié)構(gòu)。在這種方法中，蛋白質(zhì)進(jìn)行晶體生長(zhǎng)，它們以相同的方式排列并形成晶體。然后，X射線穿過晶體并擊中探測(cè)器，所形成的圖案被用來確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。   雖然Puno博士能夠結(jié)晶NEXT蛋白，但由此產(chǎn)生的X射線衍射圖像不足以看到結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)。   “不過，隨后出現(xiàn)了冷凍電鏡革命，”他說?！袄鋬鲭婄R幫助我們可視化這種蛋白質(zhì)的樣子以及它如何結(jié)合其RNA底物。    

02

動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)的可視化      冷凍電鏡的工作原理是捕獲冷凍但非結(jié)晶的蛋白質(zhì)樣品的許多不同圖像，然后使用計(jì)算方法將它們校準(zhǔn)成終的清晰圖像。   “這幾乎就像捕捉一堆飛行中的鳥的照片，”Lima博士說：“鳥在飛行過程中又多種動(dòng)作，導(dǎo)致鳥的翅膀看起來很模糊。但是，如果我們能在所有這些不同的圖片中找到翅膀的部分，那么我們就可以通過對(duì)齊這些圖片來重建鳥的翅膀的樣子，并確定它們是如何工作的?！?  從冷凍電鏡圖片中，科學(xué)家們能夠看到NEXT蛋白形成了一個(gè)非常靈活的二聚體：這意味著NEXT蛋白的兩個(gè)單體在一起形成一個(gè)功能單元。   Puno博士說：“這真的非常非常令人費(fèi)解”，并指出這些類型的蛋白質(zhì)以前沒有可視化過二聚體的形成。     “   這幾乎就像捕捉一堆飛行中的鳥的照片   ”     —Lima  結(jié)構(gòu)生物學(xué)家     “從我們進(jìn)行的生化實(shí)驗(yàn)中，我們知道二聚化對(duì)降解很重要，”他繼續(xù)說道。“但對(duì)我們來說，尚不清楚二聚體在引導(dǎo)RNA到RNA外切體的過程中起了什么作用。   為了解開這個(gè)謎團(tuán)，研究小組希望在降解的不同步驟中捕獲相互作用的NEXT復(fù)合物，然后用冷凍電鏡將這些構(gòu)象可視化。    

03

RNA的降解與疾病       RNA降解的重要性不言而喻：有缺陷或失控的降解會(huì)引起許多疾病。例子是便是囊性纖維化，在這種情況下，一些負(fù)責(zé)編碼離子通道或者轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的信使RNA被RNA降解通路降，這使得肺粘膜中的一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)無法正常表達(dá)，從而造成粘液的堆積并導(dǎo)致呼吸嚴(yán)重受損。   “這是RNA質(zhì)量控制失調(diào)的一個(gè)典型例子，”Lima博士說。   RNA降解途徑的缺陷也在幾種類型的癌癥中發(fā)揮作用。事實(shí)上，MSK的基因檢測(cè)平臺(tái)MSK-IMPACT®檢測(cè)的與RNA外切體途徑相關(guān)的兩個(gè)突變基因，其中一個(gè)突變?cè)贜EXT蛋白上。   “不僅信使RNA需要適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制，”Lima博士解釋說。   “現(xiàn)實(shí)情況是，如果你的RNA質(zhì)量控制通路出現(xiàn)了問題，你的核糖體將不起作用，你的轉(zhuǎn)移RNA將不起作用，你的剪接體也將不起作用的話，引起一系列連鎖反應(yīng)，會(huì)有很多種疾病找上門來”   RNA所起的作用之廣解釋了為什么有缺陷的RNA降解途徑會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的致病作用。   要理解這些效應(yīng)，不僅需要對(duì)RNA外切體本身有更深入、更廣泛的了解，還需要對(duì)NEXT等“上游”蛋白質(zhì)有更深入、更廣泛的了解，這些蛋白質(zhì)有助于監(jiān)測(cè)RNA并確定RNA何時(shí)存在缺陷或不再需要。   “我們希望能在體外進(jìn)行RNA降解反應(yīng)，將樣品放入冷凍電鏡中，并捕捉到它們?cè)诠ぷ鲿r(shí)所有可能動(dòng)態(tài)構(gòu)象。”Lima博士說?！白鳛榻Y(jié)構(gòu)生物學(xué)家，我們希望能夠看到動(dòng)態(tài)的過程，重現(xiàn)其工作過程。      

04

相關(guān)文獻(xiàn)摘要         RNA質(zhì)量控制依賴于輔助因子和鏈接物來識(shí)別和準(zhǔn)備底物，以便由核糖核酸酶（如3′到5′核糖核酸外顯子）進(jìn)行降解。我們解析了人源細(xì)胞核外切體靶向蛋白（nuclear exosome targeting ，NEXT）結(jié)合RNA的復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，為底物識(shí)別以及RNA移交給RNA外切體之前作用機(jī)制提供了見解。結(jié)構(gòu)揭示了ZCCHC8作為一個(gè)支架蛋白，形成同源二聚體，和MTR4螺旋酶相互作用并介導(dǎo)將柔性較大的RBM7結(jié)合到解旋酶的核心位置。三個(gè)亞基協(xié)同作用以結(jié)合RNA：RBM7和ZCCHC8檢查3′端上游的序列，促進(jìn)MTR4捕獲RNA。ZCCHC8覆蓋了MTR4的表面，這對(duì)RNA的結(jié)合和釋放以及MPP6依賴性的招募和對(duì)接到RNA外切體核心很重要。這些相互作用，通過協(xié)調(diào)RNA的捕獲、移位和從螺旋酶中釋放到外切體中，完成RNA的降解和調(diào)控。      

總結(jié)

· RNA的質(zhì)量控制是細(xì)胞生命的重要組成部分。

· RNA外切體會(huì)降解有缺陷、有害或不再需要的RNA。

· 科學(xué)家們已經(jīng)使用冷凍電鏡來確定降解機(jī)制關(guān)鍵部分的結(jié)構(gòu)，稱為NEXT。

· NEXT蛋白的突變可導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的疾病。