揭示GSDMD的非細(xì)胞焦亡功能，誘導(dǎo)食物耐受性

機(jī)體免疫系統(tǒng)如何識別自我非我的抗原一直是免疫學(xué)的核心問題。機(jī)體已經(jīng)發(fā)展了針對自我抗原的中樞耐受機(jī)制避免免疫系統(tǒng)攻擊自身抗原（1960年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）。針對非我抗原，免疫系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展出感知病原信號（PAMP）并啟動免疫激活和清除機(jī)制的系統(tǒng)（2011年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)），但是對于一些對人體無害的抗原比如腸道中來自共生微生物或食物的抗原，免疫系統(tǒng)會選擇誘導(dǎo)外周耐受機(jī)制避免產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)危及自身。其中，食物抗原如何被識別并啟動免疫耐受的機(jī)制一直不甚清晰。

GSDMD蛋白作為介導(dǎo)細(xì)胞焦亡（pyroptosis）的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，近些年來受到了領(lǐng)域內(nèi)學(xué)者們的廣泛關(guān)注。其主要的功能是：當(dāng)細(xì)胞受到病原相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的信號感受器（NLR家族，AIM2蛋白以及CARD8，PYRIN等）會誘導(dǎo)形成炎癥小體（inflammasome）并激活下游caspase-1/4/5/8/11對GSDMD的N端切割產(chǎn)生p30片段進(jìn)而上細(xì)胞膜成孔引發(fā)細(xì)胞焦亡和炎性因子釋放。

這些功能主要是在髓系細(xì)胞中進(jìn)行探索時(shí)被發(fā)現(xiàn)，而在生理狀態(tài)下，GSDMD在多種組織器官中都有著廣泛表達(dá)，并且作為gasdermin家族的成員，GSDMD在腸道尤其小腸也有著極高的表達(dá)量，GSDMD的非焦亡功能以及在腸道發(fā)揮什么具體的生理作用也因此成為了亟待探索的科學(xué)問題。

該研究發(fā)現(xiàn)了十二指腸中GSDMD可以被食物抗原誘導(dǎo)剪切N端產(chǎn)生p13片段，并入核調(diào)控腸道上皮細(xì)胞 （IECs） 的二類分子水平，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性的Tr1細(xì)胞介導(dǎo)食物耐受。

研究團(tuán)隊(duì)首先針對生理狀態(tài)下各個(gè)組織細(xì)胞的GSDMD進(jìn)行了蛋白印跡檢測，發(fā)現(xiàn)檢測的各組織樣品中只有在小腸的IEC中能檢測到一條大約13kD大小的剪切帶，通過使用氨基酸水解食物（AAD amino acid diet），研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)這一條剪切帶來自GSDMD的N端并且是受到食物抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的。

隨后研究人員通過IP-MS技術(shù)并進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該片段是由食物抗原激活十二指腸IECs中的CASPASE-3/7切割GSDMD的88位天冬氨酸（人源GSDMD是87位）產(chǎn)生，并依此構(gòu)建了GSDMD的小腸剪切突變GsdmdSICR鼠以進(jìn)行后續(xù)研究。

那么，GSDMD的這一剪切在小腸中發(fā)揮著什么作用呢？研究人員首先構(gòu)建了GSDMD的N 13 以及對應(yīng)的C 42 片段的熒光質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)N 13 片段會入核，并且發(fā)現(xiàn)輔助其入核的很有可能是核孔復(fù)合體的蛋白成員。通過比對GSDMD 野生鼠和敲除鼠的前端小腸IEC的RNA seq發(fā)現(xiàn)，GSDMD敲除會導(dǎo)致IEC的二類分子以及二類分子的轉(zhuǎn)錄因子Ciita的水平下降，隨即針對多種基因編輯以及特殊處理小鼠前端小腸IEC的二類分子的FACS以及qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)：即GSDMD的N 13 片段缺失會導(dǎo)致前端小腸IEC的二類分子表達(dá)水平降低。并且這一過程是通過N 13 片段影響STAT1對Ciita的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而缺失N 13 片段會使CIITA表達(dá)減少進(jìn)而導(dǎo)致二類分子表達(dá)下降造成的。后續(xù)的單細(xì)胞RNA測序結(jié)果證實(shí)，生理狀態(tài)下的這一變化只會發(fā)生的IEC中，對于其他經(jīng)典的抗原遞呈細(xì)胞（包括B細(xì)胞和髓系細(xì)胞）則沒有影響。

并且，通過單細(xì)胞RNA測序結(jié)果，研究人員發(fā)現(xiàn)，前端小腸的Tr1細(xì)胞在N 13 片段缺失后明顯減少，qPCR結(jié)果和FACS結(jié)果進(jìn)一步佐證了N13片段缺失造成IEC二類分子下降會導(dǎo)致Tr1細(xì)胞減少。與之相呼應(yīng)的是2020年Elinav課題組曾證實(shí)腸道IEC的二類分子表達(dá)水平會影響腸道CD4 + IL-10 + FoxP3 - 的T細(xì)胞水平。而Tr1細(xì)胞作為一群免疫負(fù)調(diào)CD4+T細(xì)胞，也被認(rèn)為是誘導(dǎo)食物耐受的關(guān)鍵細(xì)胞之一，再結(jié)合N 13 片段是由食物誘導(dǎo)產(chǎn)生且前端小腸具有營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收的生理功能，研究人員猜測N 13 片段會參與誘導(dǎo)食物耐受。為此，研究團(tuán)隊(duì)針對多種基因表達(dá)背景小鼠構(gòu)建了兩組食物耐受模型，花生提取物誘導(dǎo)的花生過敏模型以及OVA誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型，發(fā)現(xiàn)無法產(chǎn)生N 13 片段的 Gsdmd SICR 鼠、IEC MHCII在IEC特異敲除以及Tr1缺失的小鼠都呈現(xiàn)強(qiáng)烈的針對食物的過敏反應(yīng)。

該工作詳細(xì)闡述了GSDMD在前端小腸中會在食物誘導(dǎo)下形成一個(gè)N 13 剪切，該片段在核孔復(fù)合物幫助下入核并輔助增強(qiáng)了STAT1對Ciita的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，使IEC的二類分子表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)Tr1的上調(diào)，促進(jìn)食物耐受形成，為維持宿主腸道穩(wěn)態(tài)發(fā)揮了重要作用。

GSDMD分子在不同細(xì)胞中應(yīng)對病原以及食物抗原，通過產(chǎn)生不同的剪切形式，行使上膜打孔或入核參與轉(zhuǎn)錄分別誘導(dǎo)免疫激活或免疫耐受，體現(xiàn)了同一個(gè)免疫分子的功能兩面性。