單個B細胞技術(shù)在肝臟疾病中的應用

單克隆抗體是具有高度特異性的抗體，目前已廣泛應用于多種疾病，尤其是在各種病毒引發(fā)的肝損傷的治療和研究中，顯示出了不可替代的作用。近年來基于單個B淋巴細胞直接制備的人源性單克隆抗體具有抗原特異性高、免疫原性低及安全高效等優(yōu)點，越來越受到矚目，在肝臟疾病的治療和研究中展現(xiàn)出了廣闊的應用前景。

近年來，在各種急慢性肝炎尤其是 HBV、HCV、HDV 和 HEV感染導致的病毒性肝損傷的生物治療及科學研究中涌現(xiàn)出了大量的單克隆抗體。這些單克隆抗體大部分集中應用于干涉和干擾肝炎病毒的傳播和肝臟的感染。如在治療肝移植后供肝急性HCV 再感染的研究方面的抗 B 族Ⅰ型清道夫受體人單克隆抗體、HCV1 抗體和甘露聚糖結(jié)合凝集素－HCV1抗體等。目前已知的應用于肝臟疾病的單克隆抗體的研究主要傾向于抗體的種類、結(jié)構(gòu)、功能、特異性結(jié)合位點和疾病感染的類型、階段等方面，但有關(guān)單克隆抗體的制備方法的論述和研究卻并不多見，且這些單克隆抗體的制備方法大都為較為傳統(tǒng)的抗體制備技術(shù)。因此，選擇先進高效的單克隆抗體的制備技術(shù)將為肝臟疾病的生物治療和科學研究帶來廣闊的發(fā)展前景。

該技術(shù)以單個B細胞為起始點，利用每個B細胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，直接從免疫的兔子中通過隨機分離和抗原特異性分離兩種方式從外周血或淋巴組織中分離單B細胞，從單個B細胞中擴增出抗體基因，進而獲得抗原特異性抗體。該技術(shù)所制備的抗體具有高通量、高效率、高穩(wěn)定性、高特異性等優(yōu)點，保留了豐富的基因多樣性和輕重鏈可變區(qū)的天然配對，應用前景廣泛，是高效的抗體篩選方法之一。特別是在快速應對病原微生物傳染病的抗體開發(fā)上有著巨大優(yōu)勢。

吉林大學白求恩第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院研究人員基于單個B細胞技術(shù)，建立外周血單個抗體分泌細胞分離和單個細胞RT-PCR系統(tǒng)，高效快速克隆高度特異性、全人源性的HBV單克隆抗體。研究人員選擇3例HBV感染恢復期患者，從外周血中富集B淋巴細胞，加入HBcAg Peptide pool活化B淋巴細胞，流式分選出記憶性抗體分泌細胞(CD19~+CD10~-IgG~+CD27~+)，通過有限稀釋法獲得單個細胞，單細胞RT-PCR反轉(zhuǎn)出cDNA，巢式PCR擴增抗體重鏈恒定區(qū)序列片段，將PCR產(chǎn)物純化并克隆至pEASY~-T1 simple克隆載體，進行測序鑒定。

通過ELISA結(jié)果顯示，3例HBV感染恢復期患者血漿中均檢測到較高水平IgG，與健康志愿者相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均0.05)。流式結(jié)果顯示，B淋巴細胞比例均高于94%，且均可分離出記憶性抗體分泌細胞。從分離的抗體分泌細胞中挑選出24個含有1個形態(tài)完好的細胞，經(jīng)鑒定，其中有14個擴增成功，且條帶在200 bp左右，與預期片段大小相符。對抗體重鏈序列分析顯示成功擴增出抗體恒定區(qū)片段。這說明，通過成功構(gòu)建了單個抗體分泌細胞分離和單個細胞RT-PCR系統(tǒng)，獲得了抗體重鏈序列，為后期全人源性乙型肝炎單克隆抗體的高通量生產(chǎn)打下了堅實的基礎(chǔ)。 

單個 B 淋巴細胞抗體制備技術(shù)作為發(fā)展為迅速和成熟的一類單克隆抗體制備技術(shù)，具有準確、高效、簡便等諸多優(yōu)點，產(chǎn)生的抗體更是具有全人源性，高度抗原特異性、親和性等優(yōu)勢。因此，將 B 淋巴細胞抗體制備技術(shù)應用于肝臟疾病的治療和研究的抗體制備中，將為尋找和開拓肝臟疾病的治療、預防、診斷方法及相關(guān)科學研究開辟新的道路。