間隙連接在婦產(chǎn)科領(lǐng)域的研究進(jìn)展

   摘要 細(xì)胞間隙連接（gap junction,GJ）是相鄰細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)和信息交換的跨膜蛋白通道結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞增殖分化調(diào)控和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要作用。間隙連接蛋白（connexin,Cx）的表達(dá)直接影響子宮平滑肌瘤發(fā)生、分娩及卵泡發(fā)育等過程。間隙連接蛋白轉(zhuǎn)錄抑制、功能缺陷與包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其蛋白表達(dá)及功能的恢復(fù)使腫瘤的惡性表型逆轉(zhuǎn)。cx基因可能是新近發(fā)現(xiàn)的一類非突變型抑癌基因。

　　關(guān)鍵詞 間隙連接 抑癌基因 子宮腫瘤 妊娠 旁觀者效應(yīng)

　　細(xì)胞間存在著間隙連接、橋粒和緊密連接等連接方式。其中，細(xì)胞通過間隙連接所介導(dǎo)的細(xì)胞間隙連接通訊（gap junction intercellular communication,GJIC）[1],進(jìn)行著信息和能量物質(zhì)的交換，對細(xì)胞的新陳代謝、增殖和分化等生理過程起重要調(diào)控作用。同時，GJIC功能異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，間隙連接已成為當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究新熱點。

     間隙連接的結(jié)構(gòu)

　　間隙連接是由相鄰胞膜上的連接子（connexon）相互銜接而成。每個連接子包含六個相同啞鈴形蛋白質(zhì)亞單位——間隙連接蛋白（connexin,Cx）[2]，連接子即Cx的六聚體所形成的跨膜蛋白通道，見圖1。連接子在質(zhì)膜上常成簇出現(xiàn)，形成間隙連接斑（gap junction plaques），其數(shù)量直接影響GJIC功能。

圖1 間隙連接結(jié)構(gòu)示意圖

圖示相對應(yīng)的細(xì)胞膜上形成內(nèi)間隙連接功能

單位（連接子connexon）

　　編碼Cx的cDNA具有很高的同源性，cx基因?qū)儆谶B接蛋白的多基因家庭（a multigene family of connexins）。根據(jù)cDNA推導(dǎo)編碼蛋白的分子量，現(xiàn)已命名該家族14個成員，在各組織中的表達(dá)既有特異性，又有交叉性。

　　Cx有四個疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域[3]，分子鏈在胞膜上呈“M”形N末端和C末端定位于胞質(zhì)內(nèi)，從而形成胸質(zhì)內(nèi)的三個結(jié)構(gòu)域和胞外的二個結(jié)構(gòu)域，見圖2。Cx蛋白家族成員的同源性主要取決于胞外的二個結(jié)構(gòu)域，其次是跨膜結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)內(nèi)的差異大。保證成員之間相互作用的同時，又有組織差異性和細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)的多樣性。

 

圖2 連接蛋白拓樸學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖

圖示在細(xì)胞膜上形成的雙跨膜分子鏈

間隙連接的功能及其調(diào)節(jié)

　　相鄰細(xì)胞間通過GJIC進(jìn)行信息和能量物質(zhì)的傳遞，參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號傳遞的電偶聯(lián)。連接蛋白通道開放時，允許直徑＜1.5 nm或分子量＜1 kD的物質(zhì)通過[4]，包括無機鹽（Na+、K+、Ca2+等）[5]，第二信使cAMP,cGMP,1.4.5-三磷酸肌醇（IP3）等。

　　間隙連接通道的通透并非無選擇性，受到多種因素影響。細(xì)胞周圍pH降低，胞內(nèi)Ca2+濃度的升高可抑制GJIC功能。胞內(nèi)第二信使cAMP水平升高明顯增強GJIC能力，蛋白激酶通過改變蛋白通道的空間構(gòu)象而快速調(diào)節(jié)通道的啟閉，Cx蛋白在翻譯后的加工、修飾——磷酸化作用[6]，直接調(diào)節(jié)GJIC功能。癌基因ras、myc、neu等的表達(dá)可抑制GJIC，抑癌基因p53則有助于GJIC恢復(fù)。Ca2+依賴性粘附分子鈣粘附素（E-cadherin），某些生長因子（EGF，TGF），雌激素、孕激素，化學(xué)促癌劑的（TPA，DDT），細(xì)胞外電壓變化等對GJIC均有影響。

　　對GJIC功能的檢測采用特殊的熒光染料標(biāo)記傳輸法，即用分子量＜1 kD的Lucifer Yellow（LY）熒光染料，通過劃痕標(biāo)記或顯微注射，將LY注入單個細(xì)胞，在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察LY至周圍細(xì)胞的傳輸能力，從而判斷GJIC的功能。

間隙連接與子宮平滑肌瘤

　　自肌肉組織中發(fā)現(xiàn)cx基因以后，在幾乎全身所有組織中已鑒定出該家族14個成員。應(yīng)用Northern blot、原位雜交、Western blot發(fā)現(xiàn)，非妊娠期育齡婦女子宮平滑肌組織中普遍存在著Cx43的表達(dá)。值得注意的，是子宮平滑肌瘤中cx43 mRNA和蛋白含量明顯高于自身子宮平滑肌中的水平[7]，且伴隨17β-雌二醇（E2）的升高。這一發(fā)現(xiàn)在永生化小鼠的子宮平滑肌瘤樣細(xì)胞系SMU1-10中得到證實，有人認(rèn)為Cx43是平滑肌相關(guān)性標(biāo)志物[8]。

　　Cx43在子宮平滑肌和子宮平滑肌瘤表達(dá)的差異，體現(xiàn)出對甾體激素不同的反應(yīng)性。原代培養(yǎng)自體子宮平滑肌和平滑肌瘤細(xì)胞，Cx43間隙連接通道在17β-E2作用后會自發(fā)形成，用安宮黃體酮處理后，平滑肌瘤細(xì)胞cx43 mRNA及其蛋白含量降低50%，LY傳輸功能下降[9]。Cx在子宮平滑肌瘤的深入研究，有助于了解平滑肌瘤發(fā)生的分子機制，建立Cx介導(dǎo)的治療策略。

間隙連接與分娩

　　妊娠期子宮肌層中Cx43保持較低水平，足月分娩前和早產(chǎn)時，cx43 mRNA和蛋白急劇增加，間隙連接斑隨之大量出現(xiàn)，這一過程受到甾體激素的調(diào)節(jié)。妊娠子宮含有E2、孕酮（P），E2上調(diào)cx43 mRNA和蛋白的表達(dá)，誘發(fā)宮縮，引起分娩和早產(chǎn)。P則抑制cx43基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮相反作用，終結(jié)果要依賴E2/P的比率[10]。黃體酮拮抗劑作用于臨產(chǎn)前子宮以增加對催產(chǎn)素的敏感性，子宮肌層cx43 mRNA和蛋白顯著增加，催產(chǎn)素受體濃度無明顯變化，提示黃體酮對催產(chǎn)素的作用可能抑制Cx的功能。RU486引產(chǎn)的機制與阻斷hCG和P對cx43基因的下調(diào)作用有關(guān)[11]。

　　Cx43在宮縮過程中的分子機制與蛋白激酶C（PKC）活性有關(guān)[12]。PKC可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞cx43基因的轉(zhuǎn)錄，cx43基因啟動區(qū)含有AP-1（activating protein-1）位點，與fos/jun基因同源序列結(jié)合，分娩期PKC上調(diào)子宮肌層fos/jun，促進(jìn)cx43轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

　　Cx26在分娩過程Cx43升高前瞬時高表達(dá)，Cx43升高后開始下降，產(chǎn)前降至低點，受P的抑制[13]。Cx45在非妊娠子宮肌層出現(xiàn)，可保持到孕期，產(chǎn)前下降，產(chǎn)后恢復(fù)至非妊娠期的兩倍。推斷Cx26在分娩過程中先形成的小的間隙連接斑，為形成較大的Cx43間隙連接斑起模板作用，通過對小斑塊的補充，更易于Cx43間隙連接斑的形成。Cx43、Cx26、Cx45在同一組織、相同的環(huán)境出現(xiàn)不同的表達(dá)效果，提示cx基因表達(dá)調(diào)控可能存在不同的轉(zhuǎn)錄元件。

　　多種Cx的協(xié)同表達(dá)，提供分娩時細(xì)胞間代謝物質(zhì)、能量和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞有效地同步收縮，為分娩提供理想的環(huán)境和條件。子宮平滑肌細(xì)胞間隙連接的形成可能是足月分娩、早產(chǎn)的普遍過程和必要前提，希望對間隙連接的研究能成為治療早產(chǎn)的新手段。

間隙連接與卵巢

　　多種cx基因及其蛋白產(chǎn)物定位于卵巢，其各自分布有所不同，顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中有Cx43、Cx37、Cx30.3，內(nèi)膜中有Cx26、Cx32[14]，Cx60存在于卵泡內(nèi)膜和卵丘細(xì)胞，并受到促性腺激素的調(diào)節(jié)[15]。

　　卵細(xì)胞和顆粒細(xì)胞間的間隙連接通道包含Cx37，cx37基因和蛋白缺陷的小鼠缺乏成熟卵泡，不能排卵，并生成不成熟黃體，可能是不孕的重要分子機制[16]。

　　哺乳動物卵細(xì)胞在胎兒和新生兒期，停在減數(shù)分裂的第Ⅰ期，直到LH出現(xiàn)減數(shù)分裂便開始，在FSH參與下，青春期卵丘—卵復(fù)合物從卵泡壁上脫落形成排卵。

　　卵細(xì)胞和體細(xì)胞間通過間隙連接通道，允許代謝物質(zhì)從顆粒細(xì)胞進(jìn)入卵細(xì)胞，供生長發(fā)育需要。同時，間隙連接通道實現(xiàn)的細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是保證卵泡發(fā)育及卵子形成的高度協(xié)調(diào)性的主要調(diào)節(jié)機制，并影響卵巢激素的分泌功能。

間隙連接與腫瘤

　　結(jié)構(gòu)功能完整的細(xì)胞間隙連接對維持正常細(xì)胞生長、分化起重要作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的發(fā)生與GJIC功能缺陷密切相關(guān)，cx基因的表達(dá)對絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的生長起負(fù)調(diào)控作用，GJIC功能的恢復(fù)表現(xiàn)出腫瘤生長控制和轉(zhuǎn)化表型抑制。所以，cx基因被認(rèn)為是非突變型抑癌基因，證據(jù)如下。

　　一、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化普遍存在Cx表達(dá)缺失和GJIC功能缺陷。

　　肝細(xì)胞肝癌與正常肝相比，Cx26、Cx32、Cx43基因表達(dá)顯著下降，乳腺癌中Cx26明顯降低，肺癌細(xì)胞Cx43無表達(dá)，宮頸癌細(xì)胞系HeLa cx26、Cx43表達(dá)缺失。GJIC功能的缺陷，使惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞逃離生長控制，在轉(zhuǎn)移過程中逃避免疫監(jiān)視，轉(zhuǎn)移能力的強弱與GJIC呈負(fù)相關(guān)。

　　二、多種腫瘤促進(jìn)劑通過抑制Cx表達(dá)誘發(fā)癌變。

　　腫瘤抑制劑治療使Cx表達(dá)及GJIC有不同程度的恢復(fù)。DDT、TPA等誘導(dǎo)肝細(xì)胞肝癌，可非特異性抑制基因的轉(zhuǎn)錄或磷酸化作用。腫瘤抑制劑ATP、TFP、維甲酸處理HeLa等癌細(xì)胞，GJIC恢復(fù)，腫瘤生長抑制。

　　三、cx基因轉(zhuǎn)染抑制惡性腫瘤的生物學(xué)行為。

　　將cx26轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞[17]，細(xì)胞生長緩慢，裸鼠致瘤力顯著下降，GJIC恢復(fù)，出現(xiàn)較強的逆轉(zhuǎn)作用。比較cx43基因轉(zhuǎn)染前HeLa細(xì)胞，前者CA重復(fù)序列突變率較轉(zhuǎn)染后高20%，化學(xué)誘發(fā)HPRT基因突變率高30%[18]。cx43轉(zhuǎn)染HeLa對自發(fā)的和化學(xué)誘發(fā)的基因突變抵抗力增強。

　　腫瘤基因治療重要機理之一，是通過GJIC實現(xiàn)旁觀者效應(yīng)（bystander effect）。將單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）轉(zhuǎn)染HeLa，與未轉(zhuǎn)染的共同培養(yǎng)，加丙氧鳥苷（ganciclovir）只殺死轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)入cx43基因后重復(fù)以上實驗，轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染HSV-tk的HeLa細(xì)胞共同培養(yǎng)后都被殺滅[19]。

　　HeLa轉(zhuǎn)染cx26、HSV-tk基因，出現(xiàn)cx26-tk、cx26-tk+、cx26+tk-、cx26+tk+四種細(xì)胞，中性紅毒性實驗發(fā)現(xiàn)，只有cx26+tk-和cx26+tk+共同培養(yǎng)，加入ganciclovir出現(xiàn)明顯旁觀者殺傷效應(yīng)[20]。大量體內(nèi)和體外實驗證實，cx基因的表達(dá)及正常的GJIC功能是旁觀者效應(yīng)的重要基礎(chǔ)。

　　細(xì)胞間隙連接在生理、病理過程中的重要作用，已引起研究者的廣泛關(guān)注。希望通過對間隙連接的深入研究，為解決婦產(chǎn)科領(lǐng)域的諸多課題提供新的途徑。

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