熒光定量基因檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

王殊軼 鄒任玲 徐秀林 謝海明 葛 斌\r
（上海理工大學(xué)，上海 200093）

PCR是聚合酶鏈反應(yīng)的簡(jiǎn)稱(chēng)（Polymerase Chain Reaction），是由美國(guó)人Mullis于1986年發(fā)明可在體外快速擴(kuò)增特定基因或PCR序列的技術(shù)。這項(xiàng)新技術(shù)是根據(jù)生物體內(nèi)DNA序列能進(jìn)行快速?gòu)?fù)制的某些特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)在體外對(duì)特定DNA序列進(jìn)行快速擴(kuò)增，可在短時(shí)間內(nèi)在試管中獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異DNA序列拷貝。目前PCR技術(shù)成為應(yīng)用普遍的分子生物學(xué)技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中不可缺少的工具。

　　實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，既保持了PCR技術(shù)靈敏、快速的特點(diǎn)，又克服了以往PCR技術(shù)中存在的假陽(yáng)性污染和不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn)。另外，還有重復(fù)性好、省力、低費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是從傳統(tǒng)PCR技術(shù)發(fā)展而來(lái)，其基本原理是相同的，主要不同之處是其定量的體系。

　　1 熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的基本原理\r

　　PCR反應(yīng)程序參數(shù)（即循環(huán)參數(shù)）是指PCR循環(huán)中每一反應(yīng)步驟的溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。PCR擴(kuò)增是通過(guò)變性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）三個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，確定正確的PCR反應(yīng)程序參數(shù)是PCR成功的保證。

　?。?）變性溫度和時(shí)間：變性的目的是要使雙鏈DNA完全解鏈成單鏈。原則上變性步驟要高溫、短時(shí)，既要保證變性充分，又要保持聚合酶在整個(gè)反應(yīng)中的活性。若變性不充分，DNA雙鏈會(huì)很快恢復(fù)，PCR產(chǎn)物就會(huì)明顯減少；反之，變性溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)加快酶的失活 。典型的變性條件是95℃，時(shí)間30s，對(duì)GC含量多的靶DNA序列宜用較高的變性溫度。在解鏈溫度（Tm）下，DNA的變性僅需幾秒鐘。Tm值與靶DNA的(G+C)含量及鏈長(zhǎng)N有關(guān)。模板DNA或PCR產(chǎn)物的變性不完全，是PCR反應(yīng)失敗常見(jiàn)的一個(gè)原因。

　　（2）引物退火溫度和時(shí)間：退火的作用是使模板DNA單鏈或上一輪的反應(yīng)產(chǎn)物與引物相結(jié)合。退火溫度是指引物與模板特異結(jié)合的佳溫度，是任何PCR反應(yīng)重要的參數(shù)。引物退火的溫度和時(shí)間取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其在反應(yīng)成分中的濃度。通常退火溫度比引物的解鏈溫度（Tm）低5℃，一般用37～55℃或高一點(diǎn)，時(shí)間1min。通常退火溫度越高，PCR擴(kuò)增特異性越好。

　　（3）引物延伸溫度和時(shí)間：引物延伸是DNA聚合酶將脫氧單核苷酸逐一加到引物末端3′-OH 末端，依據(jù)模板序列合成一條互補(bǔ)新鏈的過(guò)程。引物延伸溫度取決于DNA聚合酶的適溫度 。一般在70～75℃。延伸時(shí)間取決于靶序列的長(zhǎng)度、濃度和延伸溫度，一般為1～3min。靶序列越長(zhǎng)，濃度越低，延伸溫度越低，則所需的延伸時(shí)間越長(zhǎng)；反之，所需的延伸時(shí)間越短。

　　（4）擴(kuò)增循環(huán)：DNA雙鏈高溫變性、引物退火和新鏈延伸這三個(gè)步驟進(jìn)行反復(fù)循環(huán)的次數(shù)通常需要25～40個(gè)。若DNA反應(yīng)中各項(xiàng)參數(shù)適宜，其適宜的循環(huán)次數(shù)主要取決于靶DNA的起始濃度。循環(huán)次數(shù)過(guò)多，產(chǎn)物相應(yīng)增多，但會(huì)增加非特異性產(chǎn)物的量及其復(fù)雜度；循環(huán)次數(shù)過(guò)少，會(huì)降低DNA產(chǎn)量。

　　在PRC擴(kuò)增原理的基礎(chǔ)上，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，結(jié)合兩側(cè)引物的特征，兩條引物之間加入一條與擴(kuò)增產(chǎn)物能特異性識(shí)別的探針。探針采用雙熒光標(biāo)記技術(shù)，其5′端標(biāo)記報(bào)告基因（reporter R），靠近3′端標(biāo)記淬滅基因（quencher Q）針完整的條件下報(bào)告基因產(chǎn)生熒光會(huì)被淬滅基因完全吸收，表現(xiàn)為報(bào)告基因受激后不能產(chǎn)生熒光現(xiàn)象。而若PCR擴(kuò)增過(guò)程中有特異靶基因存在，標(biāo)記探針在退火過(guò)程中與目標(biāo)基因特異性結(jié)合，PCR延伸過(guò)程中，當(dāng)引物延伸到探針位置時(shí)，Taq酶便以其5′端的報(bào)告基因擺脫了3′端淬滅基因的抑制，恢復(fù)熒光特性，從而熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以接收到熒光信號(hào)。即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物的形成是完全同步的，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比。這樣無(wú)需打開(kāi)擴(kuò)增管，在擴(kuò)增過(guò)程中，或擴(kuò)增完成后，只要通過(guò)適當(dāng)?shù)脑O(shè)備動(dòng)態(tài)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度即可推算出擴(kuò)增產(chǎn)物的量，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)跟蹤自動(dòng)化檢測(cè)或終點(diǎn)分析PCR檢測(cè)的目的。

　　定量檢測(cè)的步驟：（1）確定CT值(C表示循環(huán)數(shù)Cycle，T表示熒光域值Threshold)，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。因此CT值的重現(xiàn)性極好，即同一模 板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的CT值是恒定的。（2）利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定。獲得未知樣品的CT值后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定。

　　2 熒光定量基因檢測(cè)系統(tǒng)的總體設(shè)計(jì)

　　根據(jù)上述原理，我們進(jìn)行了熒光定量基因檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)，總體的結(jié)構(gòu)如圖1、2所示。該系統(tǒng)主要包括加基因擴(kuò)增加熱制冷系統(tǒng)與熒光檢測(cè)子系統(tǒng)。并對(duì)這兩個(gè)系統(tǒng)通過(guò)用戶操作子系統(tǒng)進(jìn)行了計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)控制，用戶可以利用本操作所提供的軟件，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板可以進(jìn)行定量分析。

　?。?）基因擴(kuò)增加熱制冷子系統(tǒng)：本系統(tǒng)采用變溫式設(shè)計(jì)，溫度范圍為0℃～100℃。用半導(dǎo)體加熱制冷技術(shù)，通過(guò)半導(dǎo)體元件式/光加熱/冷卻裝置變換三個(gè)溫度參數(shù)，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增樣品不用轉(zhuǎn)換。優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備體積小，溫度變換平穩(wěn)，升降溫速率0.1℃，有利于保持Taq DN A聚合酶的活性，但需時(shí)較長(zhǎng)（30個(gè)循環(huán)較水浴加熱制冷方法長(zhǎng)1～2h）。載樣臺(tái)采用PC-802：0.2mlx 96管固定在樣臺(tái)。

　　（2）光學(xué)檢測(cè)子系統(tǒng)利用熒光檢測(cè)原理，從光源發(fā)出的光經(jīng)過(guò)濾光片，由96根光纖直接導(dǎo)入樣品管，同時(shí)被激發(fā)的熒光信號(hào)由光纖傳導(dǎo)，通過(guò)濾光片和透鏡聚焦至CCD攝像系統(tǒng)，并在數(shù)秒內(nèi)同時(shí)完成96個(gè)樣品的熒光信號(hào)的采集和分析工作。光學(xué)檢測(cè)子系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖3所示。圖4為96個(gè)樣品管的輸入與輸出光纖布置原理圖。

　　（3）控制系統(tǒng)與數(shù)字圖像處理系統(tǒng)：在控制系統(tǒng)中用戶可對(duì)擴(kuò)增的循環(huán)過(guò)程進(jìn)行控制。在本熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)中，界面的制作采用了VB編程，在擴(kuò)增過(guò)程中將實(shí)時(shí)熒光信號(hào)及溫度信號(hào)經(jīng)過(guò)處理，以數(shù)字和曲線的方式清晰的顯示出來(lái)；同時(shí)能對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行離線處理，對(duì)于樣品的起始數(shù)通過(guò)樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)來(lái)進(jìn)行定量，同時(shí)可將結(jié)果進(jìn)行保存和打印，實(shí)現(xiàn)PCR的實(shí)時(shí)監(jiān)控。
　　
　　3 結(jié)論

　?。?）傳統(tǒng)上基因經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增后，要通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，染色，并在紫外投射儀下檢查凝膠并攝影拍照，再根據(jù)擴(kuò)增出的條帶進(jìn)行分析。本系統(tǒng)將基因擴(kuò)增系統(tǒng)與熒光檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，直接通過(guò)用戶操作系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果，使PCR方法變得更加簡(jiǎn)單、快速、可靠，減少了操作環(huán)節(jié)，并且減少了操作過(guò)程中的污染問(wèn)題。

　?。?）本系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品CT值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。