RNA干擾Fas基因表達的免疫組化半定量分析

【摘要】  　　目的：探索圖像分析技術(shù)在Fas蛋白表達檢測中的作用。方法：用Image Pro Plus（IPP）軟件圖像半定量分析技術(shù)，判定RNA干擾抑制Fas基因后小鼠肝組織免疫組織化學(xué)染色切片和Western Blot檢測的Fas蛋白表達情況。結(jié)果：RNA干擾有效抑制了Fas基因的表達，IPP圖像分析方法顯示，F(xiàn)as蛋白表達在免疫組織化學(xué)染色切片的差異與Western Blot檢測結(jié)果一致。結(jié)論：Image Pro Plus圖像分析手段有利于通過半定量的方式判定Fas蛋白表達的變化。

【關(guān)鍵詞】  RNA干擾 Fas蛋白 免疫組織化學(xué) 圖像分析

　　Issue of Effects of RNAi Inhibited Fas ex[x]pression Via Semi Quantitative Analysis of

    Immunohistochemical Image

    Liu Mingshe, Zhao Zhongfu，Zhang Guoying, et al.

    Department of Parasitology, Changzhi Medical College

    Abstract  ob[x]jective:It is surveyed the effect of image analysis in detecting ex[x]pression of Fas protein.Methods：Image Pro Plus（IPP） was used as the method of semi-quantitative image analysis on immunohistochemical slide image and on Western Blot specific protein strip image, and evaluating the expressing protein of Fas gene inhibited by RNAi. Results:Statistical analysis showed that ex[x]pression of Fas gene effectively inhibited by RNAi.The result of semi quantitative image analysis on immunohistochemical slide image accorded with the result of on Western Blot specific protein strip image.Conclusion：Image Pro Plus is useful method in analyzing the immunohistochemical images of Fas protein ex[x]pression.

    Key words  RNA interference; Fas protein; Immunohistochemical; Image analysis

　   在檢測基因表達的研究中，用免疫組織化學(xué)染色方法表明特異蛋白表達的細胞定位和染色程度來表明表達量的多少。雖然從圖像上看到了基因不同表達的差異，但要進行統(tǒng)計學(xué)處理，就應(yīng)當(dāng)把表達結(jié)果數(shù)字化。我們在進行RNA干擾Fas基因表達的研究中，運用Image Pro Plus（IPP）軟件分析了Fas蛋白表達免疫組化的實驗結(jié)果，并與Western Blot方法進行比較。探索用半定量方法分析研究基因差異性表達。

    1  材料和方法

    1.1  RNA干擾LPS誘導(dǎo)的小鼠肝臟Fas基因的表達實驗［１］

    1.2  實驗動物分組和Fas基因表達檢測

    20只BALB/c鼠隨機分為RNA干擾組（RNAi組）、腺病毒通用陰性對照組（HK組）、模型組（M組）和正常對照組（N組）4個組，每組5只［１］。采用免疫組化方法檢測肝臟組織Fas和Western Blot方法檢測各組實驗組鼠肝臟組織Fas蛋白的表達［１，２］。

    1.3  小鼠肝臟Fas蛋白表達的免疫組化數(shù)碼圖像

    實驗鼠肝臟切片進行Fas蛋白表達的免疫組化染色。在保持顯微鏡下相同光強度、數(shù)碼相機關(guān)掉自動白平衡等功能、全部用手動設(shè)置等條件下，拍攝400×數(shù)碼照片，每張切片拍攝5個視野的照片。20只鼠肝臟免疫組化數(shù)碼圖像共100幅。選擇640×480像素范圍進行裁切圖像。

    1.4  小鼠肝臟Fas蛋白表達的Western Blot檢測結(jié)果數(shù)碼圖像

    對顯色后的PVDF膜進行數(shù)碼拍攝（拍攝條件同上, 保持所有PVDF膜像素一致），每個實驗組拍攝5幅圖像，共20幅。

    1.5  數(shù)碼圖像的IPP軟件分析

    首先將IPP程序系統(tǒng)的灰度單位轉(zhuǎn)換成光密度單位。免疫組化染色圖像的分析，把圖像中呈現(xiàn)黃色的區(qū)域（Fas蛋白染色）作為AOI（area of interest）進行光密度測定分析。選擇測量area面積、density（mean）平均光密度和IOD（integrated optical density）累積光密度。Western Blot檢測數(shù)碼圖像，以Fas和β-actin蛋白表達條帶作為AOI進行IOD測定。

    1.6  統(tǒng)計分析

    用SPSS軟件對Fas蛋白表達的IOD值進行方差分析和LSD檢驗。 Western Blot結(jié)果的分析，根據(jù)Fas蛋白表達的IOD與β-actin蛋白表達的IOD比值作為相對量進行統(tǒng)計學(xué)處理。

    2  結(jié)果

    2.1  小鼠肝臟Fas蛋白表達的免疫組化檢測IPP圖像分析結(jié)果

    各組實驗鼠肝組織切片F(xiàn)as表達免疫組化染色結(jié)果（見圖1，表1）。圖中照片示每組各一只鼠免疫組化數(shù)碼圖像之一。表1  IPP圖像分析鼠肝組織Fas蛋白表達的免疫組化染色的IOD值免疫組化染色切片數(shù)碼圖像IOD值的統(tǒng)計分析顯示，不同實驗組間Fas蛋白表達差異具有顯著性（ANOVA：F=557.48,P＜0.01）。M組與HK組之間Fas表達差異沒有顯著性（t=0.114,P=0.909），而M組和HK組與RNAi組之間Fas表達差異具有顯著性（t=28.907和t=29.021，P＜0.01）。

    2.2  小鼠肝臟Fas蛋白表達的Western Blot檢測IPP圖像分析結(jié)果

    劉明社等.RNA干擾Fas基因表達的免疫組化半定量分析各組實驗鼠肝組織Fas表達經(jīng)Western Blot方法檢測（見圖2，表2）。表2  IPP圖像分析鼠肝組織Western Blot檢測Fas與β-actin蛋白表達的IOD比值 統(tǒng)計分析表明，不同處理組間Fas表達差異具有顯著性（ANOVA：F=458.046,P＜0.01）。M組與HK組之間Fas表達差異沒有顯著性（t=0.820,P=0.4282），而M組和HK組與RNAi組之間Fas表達差異具有顯著性（t=26.767和t=25.947，P＜0.01）。

    3  討論

    RNA干擾方法作為基因敲除工具有效抑制基因表達，已經(jīng)成為基因工程技術(shù)的重要手段，甚至可以作為疾病治療的藥物達到應(yīng)用［３～5］。我們運用腺病毒載體把Fas-shRNA導(dǎo)入BALB/c鼠體內(nèi)，有效抑制了內(nèi)毒素LPS誘導(dǎo)的肝細胞Fas基因的過度表達。經(jīng)過IPP圖像處理技術(shù)，對Fas基因表達的免疫組化檢測和Western Blot檢測結(jié)果進行分析，結(jié)果均表明Fas蛋白表達在RNA干擾組和未干擾組之間存在統(tǒng)計學(xué)的顯著差異性。

    IPP軟件用于免疫組化結(jié)果的半定量分析方法在病理學(xué)診斷中有廣泛的應(yīng)用價值［6～8］，非常方便于圖像資料的統(tǒng)計學(xué)分析。對Western Blot檢測結(jié)果的分析也與免疫組化染色圖像的分析一致，表明IPP的分析結(jié)果具有可靠運用價值。當(dāng)然，正確的使用IPP軟件還需要注意其對分析對象的適用性，條件設(shè)置不當(dāng)，就會造成分析結(jié)果錯誤，如必須有一致的數(shù)碼圖像采集條件、一致的實驗條件，以保證圖像的來源前提條件相同，這樣在后續(xù)的分析中才不會出現(xiàn)錯誤的結(jié)論。IPP軟件的運用于分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究，為圖形圖像的數(shù)字化分析帶來極大的幫助。

【參考文獻】
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［２］ 劉明社，汪世平，趙中夫，等．腺病毒載體RNAi技術(shù)抑制血吸蟲病小鼠肝細胞Fas表達［Ｊ］.中國人獸共患病學(xué)報,2007,23(4):358～361.

［3］ Bumcrot D, Manoharan M, Koteliansky V,et al.RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs［Ｊ］.Nat Chem Biol，2006，2:711～719.

［4］ Campochiaro PA. Potential applications for RNAi to probe pathogenesis and develop new treatments for ocular disorders［Ｊ］.Gene Ther，2006，13:559～562.

［5］ Reich SJ, Fosnot J, Kuroki A, et al.Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model［Ｊ］.Mol Vis，2003，9:210～216.

［6］ 申 洪, 陸藥丹.免疫組織化學(xué)染色的定量方法研究［Ｊ］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,1993，10:281～284.

［7］ 申 洪.免疫組織化學(xué)顯色反應(yīng)強度定量方法研究(Ⅱ)［Ｊ］.細胞與分子免疫學(xué)雜志,1994，4:33～35.

［8］ 申 洪.免疫組化染色定量方法研究(Ⅲ)［Ｊ］.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志,1995，4(1):89.

作者：劉明社 趙中夫* 張國英 張 蕓 武延雋

作者單位：1 長治醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室(046000) 2 長治醫(yī)學(xué)院傳染病學(xué)教研室 　基金項目 山西省自然基金資助項目(20051114)