微波輔助萃取-大孔樹脂分離純化龍膽苦苷的研究

【摘要】  目的建立萃取和純化龍膽中龍膽苦苷的優(yōu)化參數(shù)。方法以龍膽苦苷含量和解吸率為指標(biāo)，采用微波輔助萃取、大孔樹脂吸附純化和高效液相色譜法測(cè)定龍膽苦苷的含量。結(jié)果微波輔助萃取優(yōu)化條件：萃取劑60%乙醇，流速3 ml·min-1；大孔樹脂分離富集優(yōu)化條件為：上樣速度2.0 ml·min-1，洗脫液50%乙醇，流速1.0 ml·min-1時(shí)分離純化效果好。結(jié)論 在優(yōu)化的萃取、純化條件下制得這批龍膽原料龍膽苦苷平均含量為34.57mg·g-1。

【關(guān)鍵詞】  微波輔助萃取 HPD-100大孔樹脂 龍膽 龍膽苦苷

　　Abstract:ob[x]jectiveTo investigate the optimum parameters of extraction and purification of gentiopicrin in Gentiana scabra Bunge. MethodsMicrowave-assisted flow and macroporous absorptive resin were employed respectively in the extraction and purification processes. The content of gentiopicrin in the fractions was evaluated by HPLC. ResultsThe appropriate extraction conditions were: extractant concentration 60%（V/V）ethanol, flow rate 3 ml·min-1. When the flow rate of sample was 2.0  ml·min-1, the eluant was 50% （V/V）ethanol and flow rate was 1.0 ml·min-1, the effect of separation and purification was satisfactory. ConclusionUnder the above optimum conditions the content of gentiopicrin was 34.57mg·g-1 from this batch of Gentiana scabra Bunge.

　　Key words:Microwave-assisted flow extraction;   HPD-1001 macroporous resin;   Radix Gentianae;  Gentiopicrin
    
　　龍膽Gentiana scabra Bunge是一種常用中藥，有清濕熱、利肝膽的功效，龍膽中含有的主要成分為裂龍膽苦苷苷類苦味成分，如龍膽苦苷(gentiopicrin)、當(dāng)藥苦苷(swertiamarin)、當(dāng)藥苷(sweroside)等龍膽苦苷成分，研究表明龍膽苦苷為其主要活性成分，具有保肝、利膽、健胃、抗炎、抗菌等活性［1］，是評(píng)價(jià)龍膽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)重要指標(biāo)。微波輔助萃取(Microwave assisted extraction, MAE)與傳統(tǒng)的索氏萃取方法比較，MAE能夠縮短萃取時(shí)間，減少能耗及溶劑用量，在大部分情況下能夠提高萃取產(chǎn)率。而大孔吸附樹脂具有良好的吸附性及一定選擇性，在中草藥有效成分的分離純化方面得到廣泛應(yīng)用［2］。

    本文以龍膽中的主要成分龍膽苦苷含量為指標(biāo)，結(jié)合MAE和大孔樹脂優(yōu)點(diǎn)，初步考察影響微波萃取和大孔樹脂分離富集龍膽中龍膽苦苷成分的參數(shù)。

　　1  器材

    龍膽采自麗水市郊大山峰，海拔1 500 m左右，經(jīng)李水福中藥師鑒定為龍膽Gentiana scabra Bunge.，去梗，60℃恒溫烘干，粉碎，過40目銅篩得試樣；龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)110770-200510，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；HPD-100大孔樹脂（滄州寶恩化工有限公司）；Agilent1100高效液相色譜儀，20 μl定量進(jìn)樣環(huán)；流動(dòng)微波提取裝置：將WD800TL23-K3型格蘭仕微波爐進(jìn)行改造，在微波爐側(cè)面開兩個(gè)間距9 cm、直徑為0.5 cm孔；乙醇(分析純)，甲醇(色譜純)。

　　2  方法與結(jié)果

　　2.1  試樣中龍膽苦苷含量測(cè)定

　　Agilent ZOBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱；檢測(cè)器DAD，參照文獻(xiàn)［3］選擇色譜條件為：檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；柱溫25℃；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸(10:90→60:40,0→30)；流速1.0 ml·min-1。準(zhǔn)確稱取在P2O5干燥12 h的對(duì)照品9.4 mg，用甲醇-0.4%磷酸（1+1）溶解并定容至10ml，混勻，分別吸取0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml于5ml容量瓶中，甲醇-0.4%磷酸（1+1）定容，每份平行測(cè)定3次，求峰面積均值，以峰面積均值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，龍膽苦苷質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=27 463X+70 451，r=0.997 4，線性范圍：0.94～7.52 μg。在相同色譜條件下分析各試液，以外標(biāo)曲線法計(jì)算各試液中龍膽苦苷含量。

　　2.2   微波協(xié)助萃取龍膽苦苷成分

　　2.2.1  乙醇濃度對(duì)萃取率的影響

　　準(zhǔn)確稱取由四分法所得適量的試樣1.52 g，放入提取管（內(nèi)徑約12 mm），提取管上下用玻璃棉封好，放入改造后的微波爐內(nèi)進(jìn)行微波提取，微波輸出功率為480W（中火檔），占空比為40%。用蠕動(dòng)泵以3.0 ml·min-1流速各次將10%，30%，50%，75%，95%濃度（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液30 ml泵入提取管內(nèi)，開微波爐，收集萃取液，萃取完成后，關(guān)閉微波爐，繼續(xù)泵入5 ml原乙醇溶液淋洗，淋洗液合并到萃取液中，經(jīng)旋蒸濃縮干燥后采用HPLC 法測(cè)定龍膽苦苷含量，結(jié)果如圖1。從圖1看出，當(dāng)乙醇濃度50%與75%時(shí)萃取率佳，結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本，確定萃取液為60%乙醇。

　　2.2.2  萃取劑流速的影響

　　改變萃取劑流速，分別泵入60%的乙醇30 ml，收集萃取液并用HPLC法測(cè)定，結(jié)果如圖2所示，隨萃取劑流速的增加，目標(biāo)成分被萃取量先逐漸增加，當(dāng)流速3ml·min-1(即萃取時(shí)間為10 min)時(shí)，萃取量達(dá)大。

　　2.2.3  萃取劑體積的影響  
 
　　稱取試樣1.35 g，選萃取劑流速3.0 ml·min-1，每次收集3 ml萃取液，共15 次，測(cè)定各份萃取液中龍膽苦苷含量，結(jié)果表明第1份到第4份萃取液中龍膽苦苷含量均高，第5份開始下降，到第9份、第10份時(shí)龍膽苦苷含量很低了，說明大部分目標(biāo)成分在30 ml內(nèi)萃取完成，因此確定萃取劑體積30 ml，萃取劑體積與試樣質(zhì)量比值約為22∶1。

　　2.3  大孔吸附樹脂分離純化龍膽苦苷

　　2.3.1  大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附量的測(cè)定

　　經(jīng)大孔吸附樹脂預(yù)試驗(yàn)，以HPD-100型大孔吸附樹脂對(duì)龍膽苦苷的吸附能力較好。取以上預(yù)處理好的樹脂4份各5 g ，濕法裝柱（1.0 cm×15 cm），按文獻(xiàn)［4］方法預(yù)處理好。取萃取優(yōu)化參數(shù)下所得提取液，減壓旋干，蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶并定容，每份含龍膽苦苷約110 mg，上柱，上樣速度依次為1.0，1.5，2.0，2.5 ml·min-1，按《中國(guó)藥典》2005 年版Ⅰ部龍膽薄層鑒別方法檢測(cè)，與龍膽苦苷對(duì)照品比對(duì)，剛出現(xiàn)斑點(diǎn)即停止上樣，根據(jù)剩余試液量求得各流速下動(dòng)態(tài)飽和吸附量依次為19.48，18.57，18.12，16. 31 mg/g干樹脂，考慮時(shí)效因素，確定上樣速度2.0 ml·min-1。

　　2.3.2 洗脫液乙醇濃度的確定

　　按2.0 ml·min-1上樣速度處理大孔吸附樹脂柱5份，先飽和吸附，然后用蒸餾水洗脫至洗脫液還原糖反應(yīng)(Molish 反應(yīng))為陰性，再分別用10%，30%，50 %，75%，95 %乙醇溶液以2.0 ml·min-1流速洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，收集洗脫液，按HPLC法測(cè)定各收集液中龍膽苦苷量，參照文獻(xiàn)［5］計(jì)算解吸率，結(jié)果如圖4。從圖4可知，由于10%，30%乙醇溶液極性較大，洗脫能力有限，不能使吸附在樹脂上的龍膽苦苷完全解吸，50%乙醇溶液則能使龍膽苦苷等快速解吸，故確定50%乙醇溶液為洗脫液。

　　2.3.3 洗脫液流速的影響

　　分別取10 g預(yù)處理好的樹脂4份，濕法裝柱，以2.0 ml·min-1速度上樣，飽和吸附，以50%乙醇溶液在1.0，1.5，2.0，2.5 ml·min-1流速下洗脫，薄層檢測(cè)，收集流出液，HPLC法測(cè)各收集液龍膽苦苷量，計(jì)算解吸率，結(jié)果如圖5。洗脫流速直接影響到洗脫液和樹脂的交換時(shí)間，流速太快，兩者接觸時(shí)間短，未能充分解吸而增加了洗脫劑用量，從而增加了操作成本和后續(xù)濃縮成本；流速慢，雖解吸效果好，但操作周期加長(zhǎng)，增加了生產(chǎn)成本。圖5表明，洗脫流速0.5～1.0 ml·min-1時(shí)洗脫效果好，考慮操作效率，選擇洗脫液流速1.0 ml·min-1。

　　2.4  驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按“2.2”方法所得優(yōu)化萃取參數(shù)制備龍膽提取液3份，每份含龍膽苦苷100～110 mg，分別上3個(gè)預(yù)處理好的大孔吸附樹脂柱，在優(yōu)化的分離純化條件下進(jìn)行吸附與解吸，HPLC法測(cè)定收集液中龍膽苦苷量。結(jié)果表明HPD100大孔吸附樹脂平均動(dòng)態(tài)吸附量為19.07 mg/g干樹脂，平均解吸率93.5%，依此制得這批龍膽原料龍膽苦苷平均含量為34.57 mg·g-1。

　　3  討論

    微波協(xié)助萃取中萃取劑乙醇濃度是影響微波萃取效果重要因素，它不僅影響試樣對(duì)微波的吸收，而且影響目標(biāo)物的溶出，是提高萃取率和萃取選擇性的重要因素；其次，萃取劑流速也是較重要的因素，因?yàn)楫?dāng)提取管體積一定時(shí)，流速越大，受微波輻射時(shí)間越短，就不能充分地與滲入試樣中的萃取溶液形成濃差擴(kuò)散，另外適宜的流速也有利于降低成本。在分離純化龍膽苦苷過程中，上樣速度不能太快，以免上柱液中目標(biāo)成分不能充分地被樹脂吸附而過早滲漏，不能形成動(dòng)態(tài)飽和吸附平衡；要控制好洗脫液的極性，保持其適宜洗脫能力，既能把絕大部分目標(biāo)成分解吸下來，又不能洗脫下過多的雜質(zhì)而影響產(chǎn)品純度。如果能把微波輔助萃取與大孔吸附樹脂分離純化偶聯(lián)起來，一定會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。

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作者：王良貴