骨碎補總黃酮治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的實驗研究

李賀1,王宸1,陳昌紅2,段繼強1 作者單位：1. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 骨科,江蘇 南京 210009; 2. 江陰市中醫(yī)院 骨科,江蘇 江陰

　　【摘要】目的:探討中藥骨碎補總黃酮對兔膝前交叉韌帶切斷(ACLT)骨關(guān)節(jié)炎模型的作用機制。方法：新西蘭大白兔30只,隨機分為5組,即假手術(shù)組、ACLT 4周組、ACLT 8周組、骨碎補總黃酮4周組和骨碎補總黃酮8周組,每組6只。按照前交叉韌帶切斷法建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型。于實驗第4、8周處死動物,用ELISA法檢測血清IL1β及PGE2水平,用硝酸還原酶法測定關(guān)節(jié)液中NO含量,并切取關(guān)節(jié)軟骨,用RTPCR方法測定誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(the inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達(dá)。結(jié)果：前交叉韌帶切斷各組IL1β、PGE2、NO及iNOS表達(dá)量較假手術(shù)組明顯增高(P<0.05),并隨著造模時間的延長,其表達(dá)量持續(xù)增加(P<0.05)。骨碎補總黃酮組較ACLT組表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論：IL1β、PGE2、NO在骨關(guān)節(jié)炎的病理過程中起重要作用,并隨著造模時間的延長,其表達(dá)量持續(xù)增加。中藥骨碎補總黃酮對上述因子有抑制作用,并能下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨iNOS的表達(dá),從而能夠達(dá)到防治、治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。

　　【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎; 骨碎補總黃酮; 細(xì)胞因子; 一氧化氮; 一氧化氮合酶; 兔

　　[Abstract] ob[x]jective: To investigate the effect of traditional Chinese medicine osteopractic total flavone(OTF) on rabbit anterior cruciate ligament transection (ACLT) model of osteoarthritis in rats. Methods: 30 New Zealand white rabbits were randomly divided into five groups of six rabbits each: Shamoperated group, ACLT 4week group, ACLT 8week group, OTF 4week group, OTF 8week group. In accordance with anterior cruciate ligament transection model of knee osteoarthritis was established in rabbits. At 4 and 8 weeks the experimental animals were killed, serum levels of IL1β and PGE2 were examined by ELISA, and NO content in synovial fluid was determined by nitrate reductase. Pieces of articular cartilage were cut, and the ex[x]pression of iNOS was measured by RTPCR. Results: The ex[x]pression levels of IL1β, PGE2, NO and iNOS in anterior cruciate ligament transection groups were significantly higher compared with shamoperated group(P<0.05), and increased with modeling time(P<0.05). The ex[x]pressions in osteopractic total flavone groups were significantly lower than those in the ACLT groups(P<0.05). Conclusion: IL1β, PGE2, NO in the pathological process of osteoarthritis may play an important role. Chinese medicine osteopractic total flavonoids can inhibit the abovementioned factors and downregulate iNOS ex[x]pression in articular cartilage, which can help to achieve the goal of prevention and treatment of osteoarthritis.

　　[Key words] osteoarthritis; osteopractic total flavone; cytokines; NO; iNOS; rabbits

　　骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的關(guān)節(jié)病變,以中老年居多。雖然骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和流行病學(xué)的文獻記載有限,但全世界的研究表明,60歲以上的人群中約9.6%的男性和18%的女性有骨關(guān)節(jié)炎的癥狀[1]。因此,骨關(guān)節(jié)炎又被稱為“下半生疾病”。西藥長期使用不僅副作用大,而且費用較高;傳統(tǒng)中藥在這方面有其獨特療效和優(yōu)勢。其中骨碎補作為常用中藥之一,小,在較多組方中均被選用并取得了較好療效。本項目擬通過單用骨碎補總黃酮對骨關(guān)節(jié)炎動物模型的干預(yù)及治療,探討骨碎補對骨關(guān)節(jié)炎作用的機制。

　　1 材料和方法

　　1.1 實驗動物

　　健康新西蘭大白兔30只,雌雄不限,體質(zhì)量2.0～2.5 kg,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧場兔所提供。

　　1.2 主要試劑及藥品

　　骨碎補總黃酮(商品名：強骨膠囊,國藥準(zhǔn)字：Z20030007),規(guī)格：每粒裝0.25 g,12粒·盒-1,由北京岐黃制藥有限公司提供;ELISA法檢測IL1β、前列腺素E2(PGE2)試劑盒由R&D公司提供;NO試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;Trizol reagent、RTPCR試劑盒購于日本TaKaRa公司。

　　1.3 實驗分組

　　健康新西蘭大白兔30只,按隨機原則分為5組,即假手術(shù)組、前交叉韌帶切斷法(anterior cruciate ligament transected,ACLT)4周組、ACLT 8周組、骨碎補總黃酮4周組、骨碎補總黃酮8周組,每組6只。

　　1.4 動物模型制備

　　采用前交叉韌帶切斷法造模[2]。2%戊巴比妥鈉以30 mg·kg-1耳緣靜脈注射麻醉。右膝部用脫毛劑去毛, 然后用0.5%的碘伏消毒。在膝內(nèi)側(cè)做2 cm縱形切口,依次切開皮膚、皮下組織及筋膜,打開關(guān)節(jié)囊,將髕骨向外側(cè)脫位,暴露前交叉韌帶。切斷前交叉韌帶,并切除斷端1～2 mm,防止術(shù)后粘連。沖洗關(guān)節(jié)腔后依次縫合傷口,無菌敷料包扎。術(shù)后3 d肌肉注射青霉素,40萬U·d-1。分籠飼養(yǎng),術(shù)后注意觀察兔的飲食等情況。假手術(shù)組僅做皮膚切口,不切斷前交叉韌帶。定期驅(qū)趕兔子,30 min·次-1。

　　1.5 給藥

　　骨碎補總黃酮組術(shù)后按照人兔體表面積換算公式計算用量,制作成小膠囊,每日定時喂服。

　　1.6 取材

　　在術(shù)后第4、8周于耳緣靜脈取血,在4 ℃條件下以3 000 r·min-1離心5 min,提取血清。耳緣靜脈空氣栓塞處死動物,在無菌條件下暴露右膝關(guān)節(jié),向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1 ml生理鹽水,用注射器混勻后抽取關(guān)節(jié)液。切取右膝關(guān)節(jié)股骨髁及脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨。標(biāo)本置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br />
　　1.7 檢測

　　血清IL1β、PGE2的測定參照ELISA試劑盒使用說明書,以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù)。關(guān)節(jié)液NO的測定采用硝酸還原酶法,按試劑盒說明操作。

　　iNOS(片段大小為262 bp)：正義鏈5′CGCCCTTC

　　CGCAGTTCT3′,反義鏈5′TCCAGGAGGACATGCAGC

　　AC3′;GAPDH(片段大小為118 bp):正義鏈5′ATGT

　　TTGTGATGGGCGTGAA3′,反義鏈：5′CGAAGTGGTC

　　GTGGATGA3′。RTPCR反應(yīng)：每50～100 mg軟骨組織中加入1 ml Trizol提取RNA,總步驟參照TaKaRa試劑盒。反應(yīng)條件：95 ℃變性45 s,65 ℃(iNOS)或60 ℃(GAPDH)退火45 s,72 ℃延伸45 s。iNOS行35個循環(huán),GAPDH行30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。紫外透射儀下觀察擴增產(chǎn)物特異條帶。

　　1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

　　使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以x±s表示。計量數(shù)據(jù)資料采用方差分析,樣本均數(shù)間的兩兩比較用LSD檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 骨碎補總黃酮對兔血清IL1β、PGE2水平的影響 ACLT組血清中IL1β、PGE2表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯增高,而骨碎補總黃酮能顯著降低血清中IL1β、PGE2的表達(dá)。見表1。表1 各組血清IL1β、PGE2水平的比較

　　2.2 骨碎補總黃酮對兔膝關(guān)節(jié)液NO水平的影響

　　假手術(shù)組、ACLT 4周組、ACLT 8周組、骨碎補總黃酮4周組和骨碎補總黃酮8周組NO的檢測水平分別為(12.64±1.72)、(31.82±3.90)、(85.21±6.08)、(19.95±2.93)和(59.20±4.33)mmol·L-1。各組NO的表達(dá)均較假手術(shù)組增高P<0.05,并隨著造模時間的延長ACLT 8周組NO表達(dá)水平顯著高于ACLT 4周組(P<0.05),骨碎補總黃酮組NO表達(dá)水平則顯著低于同期ACLT組(P<0.05)。

　　2.3 骨碎補總黃酮對兔膝關(guān)節(jié)軟骨iNOS水平的影響 骨碎補總黃酮各組iNOS的mRNA的表達(dá)量(即與GAPDH的比值)與ACLT組有明顯差異(P<0.05)，見圖1。M. Marker; 1. 假手術(shù)組; 2. ACLT 4周組; 3. ACLT 8周組; 4. 骨碎補總黃酮4周組; 5. 骨碎補總黃酮8周組

　　3 討 論

　　骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨退變、缺失,骨贅形成以及軟骨下骨重塑為特點的,其病因尚未完全清楚,但其與系統(tǒng)復(fù)雜的生物、化學(xué)、機械以及酶反應(yīng)通路等因素有關(guān)[3]。在關(guān)節(jié)組織由結(jié)構(gòu)性破壞到出現(xiàn)疼痛、腫脹、功能障礙等臨床癥狀的過程中,IL1β、PGE2等炎性介質(zhì)起到重要作用。

　　IL1β在軟骨細(xì)胞的降解、退變過程中起到重要的分解作用。IL1β有自我刺激效應(yīng),它可促進基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)合成,并激活MMPs;另一方面它可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)的合成,使膠原蛋白的降解增加,終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨進行性破壞[3]。此外,IL1還能夠刺激中性蛋白酶和前列腺素E的產(chǎn)生,加重關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng),增加破骨細(xì)胞的活性,促進骨質(zhì)吸收。

　　PGE2在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用目前仍存在爭議[4]。炎癥介質(zhì)信號調(diào)節(jié)前體,如IL1或腫瘤壞死因子(TNFα)通過誘導(dǎo)表達(dá)環(huán)氧合酶(COX)和微粒體前列腺素合成酶1的生成來促進PGE2的合成,而合成的PGE2對IL1的表達(dá)有正反饋的促進作用,從而進一步誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[5]。這說明PGE2在骨關(guān)節(jié)炎的病理過程中是存在促進作用的。

　　一氧化氮在人體中調(diào)理各種生理和病理生理過程。在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程中,誘導(dǎo)型iNOS表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎軟骨產(chǎn)生了大量的一氧化氮和活性氧(ROS)[6]。一氧化氮同時抑制了蛋白多糖和膠原蛋白的合成,同時激活MMPs,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)[7]。NO又可誘導(dǎo)產(chǎn)生COX2和PGE2,后者可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的凋亡[8]。同時NO又可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶家族的表達(dá),通過刺激兔關(guān)節(jié)軟骨IL1的表達(dá)促進MMP1、2、3和9的mRNA轉(zhuǎn)錄增加,從而進一步促進骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[9]。

　　從中醫(yī)學(xué)角度分析,膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎屬于“痹證”范疇。目前,對其病因病機基本上有兩種看法：一是因虛致病,多因中老年肝腎虛衰,無以主骨養(yǎng)筋,風(fēng)寒濕邪入侵而致氣血瘀滯,久則骨質(zhì)增大變硬。二是因病致虛,多由閃挫跌仆,氣滯血瘀,久則肝腎虧損,脈絡(luò)失和,漸成本病?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),骨碎補對骨關(guān)節(jié)軟骨有刺激細(xì)胞代償性增生的作用,能改變軟骨細(xì)胞功能,并能部分改善由于力學(xué)應(yīng)力線改變造成的關(guān)節(jié)軟骨的退行性變,降低骨關(guān)節(jié)病的發(fā)病率及發(fā)病程度,推遲發(fā)病時間。骨碎補藥用部分為水龍骨科植物槲蕨或中華槲蕨的根莖,而骨碎補總黃酮是由其干燥根莖中提取的,是骨碎補主要有效成分。有研究表明骨碎補總黃酮具有較強的抗膝骨關(guān)節(jié)炎作用,實驗顯示骨碎補總黃酮減輕軟骨病變,顯著降低Mankin法軟骨積分[10]。戈兵等[11]實驗證實骨碎補總黃酮能夠減輕兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨退行性變和滑膜炎癥。趙晉寧等[12]進行骨碎補總黃酮的急性毒性實驗研究,用相當(dāng)于人體每日用藥量的2 700倍的骨碎補總黃酮量給小鼠灌胃,連續(xù)觀察7 d,小鼠均存活,飲食、活動、精神狀態(tài)、皮毛膚色、大小便等均無異常變化,這證實骨碎補總黃酮未顯示毒性作用,預(yù)期臨床應(yīng)用安全性良好。

　　本實驗結(jié)果顯示,ACLT模型組中兔血清中IL1β、PGE2以及關(guān)節(jié)液中NO,關(guān)節(jié)軟骨中iNOS水平高于假手術(shù)組,且8周組較4周組高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。骨碎補總黃酮組各項指數(shù)明顯低于ACLT模型組,說明中藥骨碎補總黃酮可以抑制血清IL1β、PGE2的表達(dá),并降低關(guān)節(jié)液中NO,關(guān)節(jié)軟骨中iNOS的表達(dá)水平,從而能夠達(dá)到防治、治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的作用。本研究僅限于兔前交叉韌帶切斷模型,上述作用機制是否對人體有效尚有待研究。

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