FasL mRNA在椎間盤細(xì)胞中表達(dá)的分布

作者：司春祥,陳伯華,呂振華　　作者單位：勝利石油管理局臨盤醫(yī)院骨科，山東 臨邑 251507;青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科
　　【摘要】目的 觀察凋亡相關(guān)基因FasL mRNA在椎間盤細(xì)胞中表達(dá)的分布。方法 收集胎兒及成人病理腰椎間盤髓核標(biāo)本，PHAP激活單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)FasL表達(dá)，提取總RNA，RTPCR制備FasL基因片段。定向克隆入質(zhì)粒載體pSPT19多克隆位點(diǎn)構(gòu)建重組質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄制備DigFasL cRNA探針。cRNA探針原位雜交進(jìn)行FasL mRNA表達(dá)分布的觀察。結(jié)果 克隆化FasL序列經(jīng)DNA測序準(zhǔn)確無誤，體外轉(zhuǎn)錄cRNA探針標(biāo)記效果滿意;胎兒腰椎間盤組織脊索細(xì)胞、軟骨樣細(xì)胞中可檢測到FasL mRNA的較高雜交信號，成人突出椎間盤細(xì)胞中罕見正常細(xì)胞，未檢出FasL mRNA信號。結(jié)論 FasL基因在胎兒期腰椎間盤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞凋亡發(fā)生早。成年時(shí)期，細(xì)胞數(shù)急劇減少，代謝功能低下，無法檢出凋亡基因表達(dá)。
　　【關(guān)鍵詞】 基因 FasL RNA 互補(bǔ) 椎間盤 原位雜交
　　THE DISTRIBUTION OF Fasl mRNA IN HUMAN LUMBAR DISC TISSUE　SI CHUNXIANG, CHEN BOHUA, L ZHENHUA　(Department of Orthopaedics, Shengli Oil Field Linpan Hospital, Linyi 251507, China);
　　[ABSTRACT] ob[x]jective To observe the distribution of FasL mRNA in intervertebral disc. Methods Nucleus gelatinosus specimens were collected from fetus and pathologic disc. PBMC was treated by PHAP, and total RNA extracted from the actived PBMC. A fragment of FasL gene was reversely transc[x]ripted and amplified from total RNA using onestep RTPCR. PCR product was then inserted into the MCS of pSPT19. After verification of DNA sequencing, the recombinant plasmid pSPT19 was linearized to synthesize the digcRNA probe in vitro. The distribution of FasL mRNA was observed on lumbar intervertebral disc specimens using in situ hybridization. Results The inserted FasL cDNA fragment in pSPT19FasL was identified by DNA sequencing. The label efficiency of cRNA probe was satisfied; The FasL mRNA signals were emerged in both notochord cells and chondrocytelike cells in the nucleus of fetal discs. Conclusion The FasL mRNA was detected in the fetal lumbar intervertebral disc cells, and apoptosis occurred early. In adult, the quantity of intervertebral disc cells reduced, the me[x]tabolism of them decreased, and the ex[x]pression of FasL mRNA could not be detected.
　　[KEY WORDS] Gene, FasL; RNA, complementary; Intervertebral disc; In situ hybridization
　　FasL基因是目前已知的重要的凋亡調(diào)控基因之一，屬于腫瘤壞死因子家族成員的凋亡促進(jìn)因子，是Fas的配體。體內(nèi)外多種因素可以誘發(fā)FasL的表達(dá)，通過Fas的介導(dǎo)而產(chǎn)生一系列生化反應(yīng)，終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。研究證實(shí)，椎間盤組織的間盤細(xì)胞上有FasL表達(dá)，F(xiàn)asL相關(guān)的細(xì)胞凋亡與腰椎間盤退行性變的發(fā)生有關(guān)[12]。但其mRNA表達(dá)的研究未見報(bào)道。本研究通過克隆FasL cDNA片段制備地高辛標(biāo)記的FasLcRNA探針，利用原位雜交方法對椎間盤中FasL mRNA的分布進(jìn)行觀察。
　　1 材料與方法
　　1.1 主要試劑及儀器設(shè)備
　　PHAP、DEPC購自Sigma公司，APES購自上海生物工程公司。pSPT19質(zhì)粒載體、大腸桿菌JM109、EasyHyb、分子克隆所用試劑盒、工具酶及所用儀器設(shè)備由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。
　　1.2 標(biāo)本來源
　　收集胎齡>5月的胎兒及手術(shù)取出的椎間盤髓核標(biāo)本10例，置無菌EP管中液氮速凍后-70 ℃保存。10例病人中,男6例,女4例;年齡32～65歲,中位年齡50歲;病程6月～5年，平均1.4年。L4,5者5例，L5S1者4例。
　　1.3 引物設(shè)計(jì)
　　引物依FasL mRNA序列(NM_000639.1)設(shè)計(jì)，其上游、下游引物分別來自mRNA序列。PCR產(chǎn)物長334 bp。上游引物的5′端修飾PstⅠ酶切序列，下游引物5′端構(gòu)建EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，CTC保護(hù)。引物由北京華美公司合成。上游引物:5′CTCCTGCAGGCCCTTCAATTACCCATATCCC3′，下游引物:5′CTCGAATTCGAGTTCTGCCAGCTCCTTCTGT3′。
　　1.4 人Fas L 基因片段的克隆化
　　1.4.1 FasL基因的誘導(dǎo)表達(dá)及總RNA的制備人全血1 mL，100 g/L的EDTA抗凝;分離單個(gè)核細(xì)胞，加入50 mmol/L PHAP 37 ℃激活15 min;然后37 ℃孵育1 h，QIAamp RNA blood Mini kit提取總RNA。
　　1.4.2 cDNA的合成 按照QIAamp RNA Blood Mini kit說明，在反應(yīng)混合液中加入下列試劑：5×Buffer 10 μL;10 mmol/L dNTP 2.0 μL;5×Q液10 μL;上、下游引物各0.6 μmol/L;RTPCR 酶復(fù)合物2.0 μL;Rnasin 30 U;總RNA 1 μg(經(jīng)70 ℃溫育5 min),總體積50 μL。反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)變性30 min;然后95 ℃ 15 min, 94 ℃ 1 min,52 ℃1 min,72 ℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán);后72 ℃延伸10 min。QIAquick Gel Extraction kit進(jìn)行膠上PCR產(chǎn)物回收。
　　1.4.3 PCR產(chǎn)物的克隆 PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pSPT19分別進(jìn)行EcoRⅠ、PstⅠ雙酶切，15 ℃下T4連接酶連接反應(yīng)16 h。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109(CaCl2法制備)，氨芐青霉素抗菌及PCR快速篩選獲陽性重組子。堿裂解法提取質(zhì)粒，酚氯仿法抽提。
　　1.4.4 DNA測序 委托北京華美公司測序。
　　1.5 體外轉(zhuǎn)錄制備cRNA探針
　　EcoRⅠ酶切線性化重組質(zhì)粒pSPT19，純化、定量，按試劑盒說明，RNA聚合酶T7體外轉(zhuǎn)錄制備DigFasL cRNA探針。
　　1.6 原位雜交
　　1.6.1 雜交前處理 載玻片及蓋玻片經(jīng)APES防脫片劑處理。組織塊經(jīng)40 g/L多聚甲醛PBS(pH 7.4)前固定45 min，入300 g/L蔗糖PBS過夜。OCT包埋，冷凍切片，厚度10 μm。40 g/L多聚甲醛PBS (pH 7.4)后固定10 min，PBS洗滌3 min，共2次。37 ℃烤干2 h。密封，-70 ℃貯存。
　　1.6.2 原位雜交 切片復(fù)溫， 2 g/L Triton X100PBS液洗15 min后，PBS洗3 min，共2次;10 mg/L蛋白酶37 ℃消化15 min;冰預(yù)冷的2 g/L GlycinePBS液洗3 min，3次; 2.5 g/L乙酸酐作用10 min后PBS液洗3 min;EasyHyb中按1 g/L加入cRNA探針制備雜交液，每片加30 μL，加蓋玻片。封口膜封閉，置入濕盒，42 ℃下雜交16 h。
　　1.6.3 雜交后處理 2×SSC 42 ℃洗滌5 min，共4次;0.1×SSC 42 ℃洗滌30 min，共2次;Buffer1液25 ℃振蕩洗滌2 min;Buffer2液25 ℃振蕩洗滌3 min;抗Dig抗體(1∶1500) 37 ℃作用2 h;Buffer1作用 15 min，共2次;Buffer3 作用3 min。切片加顯色液(buffer3+ NBT/BCIP)37 ℃顯色2 h。Buffer1分別作用5、2 min終止顯色并攝影。
　　1.7 結(jié)果判斷
　　以細(xì)胞胞漿出現(xiàn)藍(lán)紫色染色為FasL mRNA陽性信號。
　　2 結(jié)果
　　2.1 RTPCR產(chǎn)物的鑒定
　　RTPCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上電泳顯示，在約328 bp處呈現(xiàn)1條與預(yù)期產(chǎn)物相對分子質(zhì)量大小相符的DNA擴(kuò)增條帶。
　　　M為pGEM7Zf(+)DNA/Hae Ⅲ Marker;F為RTPCR產(chǎn)物。
　　2.2 DNA測序
　　雙脫氧法測序結(jié)果與GenBank(NM_000639.1)中發(fā)表的序列相符，證實(shí)插入的FasL序列準(zhǔn)確無誤。
　　2.3 胎兒及成人椎間盤的觀察
　　胎兒腰椎間盤組織中，髓核部位可見脊索細(xì)胞、軟骨樣細(xì)胞分布較為密集，形態(tài)正常。髓核近中央部位部分細(xì)胞成簇排列，胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)紫色染色顆粒，表達(dá)FasL mRNA 陽性信號。周邊近纖維環(huán)區(qū)細(xì)胞密集，弱陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞混雜。纖維環(huán)部位膠原纖維排列整齊，少見細(xì)胞。突出髓核可見椎間盤組織呈典型的退行性改變，髓核纖維化顯著，膠原纖維排列紊亂，基質(zhì)出現(xiàn)大量空泡樣變，細(xì)胞含量稀少，罕見正常細(xì)胞，未檢出FasL mRNA信號。
　　3 討論
　　3.1 DigFasL cRNA 探針與mRNA的檢測
　　常用的檢測mRNA的方法有原位雜交、Northern blot、Dot blot、RTPCR等多種方法。ANGERER等[1]首先應(yīng)用RNA探針于原位雜交。與cDNA探針相比，cRNA探針有與組織中mRNA雜交效率高、雜交體穩(wěn)定、假陽性少、雜交前不用高溫變性等優(yōu)點(diǎn)。因此，使用cRNA探針可使實(shí)驗(yàn)有更高的嚴(yán)謹(jǐn)性[2]。用地高辛標(biāo)記的探針具有對人體無害且可長期保存[3]，特異性強(qiáng)的優(yōu)越性。cRNA探針不僅可應(yīng)用于切片上的原位雜交，還可應(yīng)用于Southern印跡雜交法檢測特定基因組序列等。
　　3.2 腰椎間盤退行性變與細(xì)胞凋亡
　　腰椎間盤退變的發(fā)病機(jī)制是多因素的。非生理性的機(jī)械負(fù)重是一個(gè)中心病因?qū)W因素，生物學(xué)因素也起了重要的作用。KOHYAMA等[4]證實(shí)在突出的椎間盤中細(xì)胞凋亡的發(fā)生率高于對照組。JEFFREY等[5]應(yīng)用外部壓縮裝置研究靜態(tài)壓縮應(yīng)力對椎間盤的作用，表明凋亡細(xì)胞的百分率與壓縮應(yīng)力及負(fù)載時(shí)間有關(guān)。GRUBER等[6]報(bào)道，在腰椎間盤中細(xì)胞凋亡的發(fā)生率高、細(xì)胞活性降低并在增齡和退變過程中產(chǎn)生片狀產(chǎn)物，圍繞在細(xì)胞周圍形成隔離屏障，可影響單個(gè)核細(xì)胞的活性和細(xì)胞間通訊。
　　3.3 FasL與腰椎間盤退變
　　退變腰椎間盤的主要病理改變?yōu)橐蚨喾N原因所致的細(xì)胞凋亡，椎間盤細(xì)胞數(shù)量減少及椎間盤基質(zhì)的降解。當(dāng)軟骨樣細(xì)胞死亡增加，其合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力下降，不能有效地維持椎間盤基質(zhì)的膠體滲透壓，從而導(dǎo)致椎間盤脫水及退變。Fas/FasL系統(tǒng)參與突出椎間盤組織細(xì)胞的凋亡。
　　TROUT認(rèn)為在脊柱發(fā)育完成后，髓核中的活細(xì)胞中仍具有功能[7]。也有人認(rèn)為椎間盤中細(xì)胞隨著年齡的增加而出現(xiàn)一定程度的增加，但有活力的細(xì)胞數(shù)目下降，其中大部分活力低下甚至死亡[8]。細(xì)胞死亡有兩種基本方式，即壞死和凋亡。研究顯示，人類腰椎間盤組織中存在凋亡的軟骨樣細(xì)胞[9]。研究證實(shí)，突出椎間盤的間盤細(xì)胞上有FasL及Fas表達(dá)。Fas/FasL可能誘導(dǎo)退變腰椎間盤組織進(jìn)行超常的凋亡，從而降低了椎間盤髓核Ⅱ型膠原的產(chǎn)生，促進(jìn)了退行性變的發(fā)生，加速了腰椎間盤突出癥的進(jìn)程[10～13]。這可能是腰椎間盤退變發(fā)生及進(jìn)展的機(jī)制之一。
　　總之，本文研究顯示，胎兒腰椎間盤內(nèi)細(xì)胞密集、形態(tài)正常，內(nèi)有FasL mRNA分布。而在腰椎管狹窄取出的椎間盤中細(xì)胞數(shù)量減少。病理性腰椎間盤中呈現(xiàn)出明顯的退行性變，細(xì)胞稀少幾乎無正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)可見，F(xiàn)asL mRNA信號未能檢出。
　　【參考文獻(xiàn)】
　　[1]ANGERER L M, ANGERER R C. Localization of mRNAs by in situ hybridization[J]. Methods Cell Biol, 1991,35:3771.
　　[2]杜衛(wèi)東,周曉虹,馬學(xué)玲,等. 地高辛標(biāo)記cDNA探針組織及細(xì)胞mRNA原位雜交技術(shù)[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 1997,13(1):7780.
　　[3]蔡文琴,王伯. 實(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)與核酸分子雜交技術(shù)[M]. 成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社, 1994:354432.
　　[4]KOHYAMA K, SAURA R, DOITA M, et al. Intervertebral disc cell apoptosis by nitric oxide: biological understanding of intervertebral disc degeneration[J]. Kobe J Med Sci, 2000,46(6):283295.
　　[5]JEFFERY C, LOTZ JENNIE R, CHIN J P, et al. Intervertebral disc cell death is dependent on the magnitude and duration of spinal loading[J]. Spine, 2000,25(12):1471.
　　[6]GRUBER H E, HANLEY E N J R. Analysis of aging and degeneration of the human intervertebral disc. Comparison of surgical specimens with normal controls[J]. Spine, 1998,23(7):751757.
　　[7]高慧英,王洪海,趙炳章. 椎間盤的形態(tài)學(xué)[M]// 魯玉來,蔡欽林. 腰椎間盤突出癥. 北京:人民軍醫(yī)出版社, 2001:50.
　　[9]BAYLISS M T, URBAN J P, JOHNSTONE B, et al. In vitro method for measuring synthesis rates in the intervertebral disc[J]. J Orthop Res, 1986,4:1017.
　　[9]GRUBER H E, HANLEY E N. Analysis of aging and degeneration of the human intervertebral disc:Comparison of surgical specimens with normal controls[J]. Spine, 1998,23:751757.
　　[10]PARK J B, KIM K M, HAN C W, et al. ex[x]pression of Fas receptor on disc cells in herniated lumbar disc tissue[J]. Spine, 2001,26(2):142146.
　　[11]JONGBEOM P, HAN C, KIWON K. ex[x]pression of Fas Ligand and apoptosis of disc cells in herniated lumbar disc tissue[J]. Spine, 2001,26(6):618621.
　　[12]KOHYAMA K, SAURA R, DOITA M, et al. Intervertebral disc cell apoptosis by nitric oxide: biological understanding of intervertebral disc degeneration[J]. Kobe J Med Sci, 2000,46(6):283295.
　　[13]金明熙,李小川,謝林. 凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物Pas/APO1蛋白在腰椎間盤組織中的表達(dá)及其意義[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2000,17(2):188.