PPARγ基因多態(tài)性與2型糖尿病脂代謝的關(guān)系

　　作者：李蘊(yùn)博,杜丹華,郭暉,高鵬　　作者單位：吉林大學(xué)醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春

　　【摘要】目的 探討PPARγ基因多態(tài)性與2型糖尿病患者脂代謝異常的關(guān)系。方法 本研究共納入191例2型糖尿病患者。以rs1875796為遺傳標(biāo)記，應(yīng)用多聚酶鏈限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCRRFLP)技術(shù)檢測(cè)PPARγ基因rs1875796的基因型。應(yīng)用氧化酶法測(cè)定入組患者血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HLDC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)的水平。結(jié)果 2型糖尿病患者PPARγ基因rs1875796的等位基因頻率與TC、HDLC和LDLC水平無明顯相關(guān)。但經(jīng)性別分層后，女性2型糖尿病患者的TC、LDLC水平與PPARγ基因rs1875796的等位基因頻率呈顯著性相關(guān)(分別為χ2=9.378，P=0.002和χ2=11.187，P=0.000 8)。攜帶C等位基因個(gè)體的TC水平和LDLC水平明顯高于攜帶T等位基因的個(gè)體。結(jié)論 女性2型糖尿病患者TC、LDLC水平與PPARγ基因ts1875796多態(tài)性可能有關(guān)。
　　【關(guān)鍵詞】 2型糖尿病;PPARγ基因;總膽固醇;低密度脂蛋白膽固醇;單核苷酸多態(tài)性
　　胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病基礎(chǔ)之一，而脂肪細(xì)胞因子分泌異常是胰島素抵抗的一個(gè)重要機(jī)制。研究表明過氧化物酶體增生物激活受體γ(peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ)在脂肪細(xì)胞分化、糖、脂代謝和肥胖特異性基因的表達(dá)中具有重要作用〔1〕。PPARγ mRNA存在三種剪接變體，即PPARγ1﹑PPARγ2和PPARγ3〔2〕，其中PPARγ2在脂肪組織中有高水平的表達(dá)〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)PPARγ介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控脂代謝特別是膽因醇的代謝〔4，5〕。目前已證實(shí)高加索人PPARγ基因多態(tài)性與2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)〔6〕。但PPARγ基因多態(tài)性與脂代謝關(guān)系的研究卻存在很大爭(zhēng)議〔7～9〕。本研究以PPARγ基因?yàn)楹蜻x基因，探討了PPARγ基因多態(tài)性與2型糖尿病患者脂代謝的關(guān)系。
　　1 資料與方法
　　1.1 研究對(duì)象

　　本院內(nèi)分泌科20052007年住院并確診為2型糖尿病的患者191例，男113例，女78例，平均年齡(56.5±11.2)歲。所有入組患者均符合1997年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)(ADA)的2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且入院前1個(gè)月未用過調(diào)脂藥物。排除嚴(yán)重的其他系統(tǒng)疾病。所有入組患者均簽署知情同意書，并采集全血用于DNA提取。
　　1.2 方法

　　1.2.1 血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)濃度的檢測(cè) 應(yīng)用氧化酶法測(cè)定。
　　1.2.2 PPARγ基因rs1875796基因型的檢則
　　選擇rs1875796(Hha I site，SNP1)和rs1699337(Hinf I site，SNP2)2個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)，采用限制性酶切片段多態(tài)性的方法檢測(cè)SNPs的基因型。①DNA提取試劑盒(Promega)提取基因組DNA。②PCR反應(yīng)：應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。SNP1位點(diǎn)上游引物：5′GTGGCTATCTTTGGCTGTTTG3′，下游引物：5′ACCAAGTGTCTGTTGCTCCTG3′;SNP2位點(diǎn)上游引物：5′TTCTTGACCACCGAGGCT3′，下游引物：5′CTCTGCGTAGCTGATTGGAC3′。PCR反應(yīng)體系為25 μl，其中雙蒸水18 μl，10 mmol TrisHCl(pH 8.3)，50 mmol KCl，1.5 mmol MgCl2，4種dNTP各200 μmol，引物各0.4 μmol，Taq DNA 聚合酶(Promega，北京) 1.0 U，基因組DNA 30～50 ng。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，后72℃延伸10 min。③酶切體系：PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶(Promega)于37℃水浴4～6 h酶切，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(90 mV)30 min，在凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技公司)下觀察結(jié)果。
　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用擬和優(yōu)度檢驗(yàn)分析2型糖尿病患者基因型頻率的分布是否符合HardyWeinberg平衡;UNPHASED遺傳學(xué)軟件〔10〕Qtphase對(duì)近似正態(tài)分布的計(jì)量資料體重指數(shù)(BMI)、TC、LDLC和HDLC進(jìn)行數(shù)量性狀分析;將不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料轉(zhuǎn)化為計(jì)數(shù)資料，應(yīng)用UNPHASED遺傳學(xué)軟件Cocaphase進(jìn)行分析。
　　2 結(jié) 果
　　2.1 SNP1和SNP2位點(diǎn)雜合度分析及SNP1位點(diǎn)HardyWeinberg平衡分析

　　在檢測(cè)的2個(gè)SNPs位點(diǎn)中，只有SNP1在中國(guó)漢族人中的多態(tài)性較高，可以作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。SNP1經(jīng)PCR擴(kuò)增及Hha I酶切后，產(chǎn)生3種基因型：野生型TT純合子，突變型CC純合子和CT雜合子?；蛐头植糃C∶CT∶TT為6∶50∶135，等位基因分布C：T為62：320。擬和優(yōu)度檢驗(yàn)表明入組患者SNP1位點(diǎn)的基因型未偏離HW平衡(病例組χ2=0.266，P=0.606;男性χ2=0.207，P=0.649;女性χ2=2.378，P=0.123)，說明選擇的樣本是隨機(jī)婚配的群體。
　　2.2 PPARγ基因rs1875796多態(tài)性與TC、HDLC、LDLC、BMI的關(guān)系
　　2型糖尿病患者PPARγ基因rs1875796的等位基因頻率與TC、HDLC、LDLC水平和BMI無明顯相關(guān)。經(jīng)性別分層后，女性2型糖尿病患者的TC、LDLC水平與PPARγ基因rs1875796的等位基因頻率呈顯著性相關(guān)(分別為χ2=9.378，P=0.002和χ2=11.187，P=0.000 8)。攜帶C等位基因個(gè)體的TC和LDLC明顯高于攜帶T等位基因的個(gè)體。男性2型糖尿病患者PPARγ基因rs1875796的等位基因頻率與TC、HDLC、LDLC水平和BMI無明顯相關(guān)(見表1～表3)。表1 PPARγ基因rs1875796的等位基因頻率與2型糖尿病體重指數(shù)及血脂水平的關(guān)系(略)表2 PPARγ基因rs1875796的等位基因頻率與女性2型糖尿病體重指數(shù)及血脂水平的關(guān)系(略)表3 PPARγ基因rs1875796的等位基因頻率與男性2型糖尿病體重指數(shù)及血脂水平的關(guān)系(略)

　　2.3 SNPs等位基因頻率與TG水平的關(guān)系
　　由于入組患者的血清TG水平不符合正態(tài)分布，因此將其轉(zhuǎn)化為計(jì)數(shù)資料進(jìn)行分析。Cocaphase分析表明SNP1的等位基因頻率在合并高TG血癥和非高TG血癥的2型糖尿病患者中無顯著差異，經(jīng)性別分層后仍無顯著性差異(P>0.05)。
　　3 討 論
　　人類PPARγ基因定位于染色體3p25，全長(zhǎng)大于200 kb，包括9個(gè)外顯子。PPAR基因的剪接變體PPARγ2在脂肪組織中有高水平的表達(dá)〔3〕，PPARγ介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控脂代謝特別是膽固醇的代謝〔4，5〕，因此PPARγ基因與脂代謝特別是膽固醇的代謝密切相關(guān)。
　　以往有關(guān)PPARγ基因多態(tài)性與脂代謝關(guān)系的研究多集中于2號(hào)外顯子區(qū)的Pro12Ala錯(cuò)義突變，但所得結(jié)論不一〔7～9〕。Pro12Ala在不同種族人群中的突變頻率不同，在中國(guó)漢族人群中的頻率較低，約1%。以往大多數(shù)以中國(guó)漢族人群為對(duì)象的研究未發(fā)現(xiàn)該錯(cuò)義突變位點(diǎn)與脂代謝或2型糖尿病的關(guān)系〔11，12〕。近研究發(fā)現(xiàn)許多與疾病相關(guān)的遺傳標(biāo)記位于非編碼區(qū)或基因功能未知的區(qū)域〔13〕，而在進(jìn)化上古老的常見多態(tài)中即使是輕微的有害變異也不會(huì)在人群進(jìn)化中保存下來〔14〕。因此本研究選擇了位于4號(hào)內(nèi)含子上的rs1875796位點(diǎn)及5號(hào)內(nèi)含子上的rs1875796位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記。
　　本研究應(yīng)用數(shù)量性狀分析方法探討了PPARγ基因rs1875796多態(tài)性與2型糖尿病患者血脂水平的關(guān)系。2型糖尿病是多基因遺傳病，它的形成是由于多個(gè)微效基因變異的共同作用引起的，這些變異在群體中的分布是連續(xù)的，在不同個(gè)體間只有量的差異，而無質(zhì)的不同，常稱這類性狀為數(shù)量性狀。因此對(duì)多基因遺傳疾病的某些連續(xù)性性狀進(jìn)行數(shù)量性狀分析更符合疾病發(fā)生的本質(zhì)。
　　本研究發(fā)現(xiàn)女性2型糖尿病患者的TC、LDLC水平與PPARγ基因rs1875796的等位基因頻率呈顯著性相關(guān)。攜帶C等位基因個(gè)體的TC水平和LDLC水平明顯高于攜帶T等位基因的個(gè)體。已有研究證實(shí)雌激素水平增高可上調(diào)PPARγ2的表達(dá)〔15〕，而PPARγ2的表達(dá)下調(diào)可引起脂代謝紊亂。本研究入組的女性患者的平均年齡為(56.8±11.5)歲，多為絕經(jīng)后及圍絕經(jīng)期女性，普遍存在雌激素缺乏。因此推測(cè)，由于女性雌激素水平降低，導(dǎo)致PPARγ2的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致了TC和LDLC水平升高。
　　此外，本研究人群來自于北方漢族人，這一研究結(jié)果還需要在不同地域、不同種族的人群中進(jìn)行大樣本的重復(fù)來驗(yàn)證。
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