實時定量PCR檢測人白血病細(xì)胞hTERT mRNA的臨床意

【摘要】目的利用實時熒光定量RT-PCR方法，檢測白血病細(xì)胞人類端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的表達(dá)水平并探討其臨床意義。方法　采用基于TaqMan熒光技術(shù)的實時定量RT-PCR方法檢測白血病患者骨髓單個核細(xì)胞及10種白血病細(xì)胞系hTERT mRNA拷貝數(shù)，來自同種基因移植供者的正常人骨髓細(xì)胞作為對照。結(jié)果　與28例正常人組相比，33例AML1/ETO融合基因陽性的急性髓性白血病(AML)患者骨髓細(xì)胞hTERT mRNA水平較高，中位數(shù)分別為8.96%(0.23%～76.73%)和 4.20%(0.21%～19.90%)(P<0.01)。47例B-ALL患者骨髓細(xì)胞hTERT mRNA水平中位數(shù)為20.80%(0.25%～1566.34%)，高于正常人組(P<0.001)及156例AML組(中位數(shù)為2.06%，范圍為0～2133.41%)。70例慢性髓性白血病(CML)、36例M3型白血病患者h(yuǎn)TERT mRNA水平中位數(shù)分別為0.57%(0～14.77%)、0.53%(0～11.10%)，均低于正常人組(P均<0.001)。15例治療后達(dá)到完全緩解的急性白血病患者與初治時相比，hTERT mRNA水平明顯下降，中位數(shù)分別為46.53%(8.96%～218.10%)和2.25%(0.18%～45.85%)(P<0.001)。10種白血病細(xì)胞系的hTERT mRNA水平差異甚大。結(jié)論　hTERT mRNA在人白血病細(xì)胞中的表達(dá)水平存在異質(zhì)性。高表達(dá)hTERT mRNA可能是B-ALL及AML1/ETO陽性的AML發(fā)病機(jī)制中的因素之一。
　　【關(guān)鍵詞】 白血病;　逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng);　hTERT

　　【Abstract】　ob[x]jective　To investigate the clinical significance of human telomerase reverse transc[x]riptase (hTERT) messenger RNA ex[x]pression in the leukemic cells by real-time fluorescent quantitative reverse transc[x]ription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay.Methods　A real-time quantitative RT-PCR ba[x]sed on TaqMan fluorescence methodology was used to quantify the hTERT mRNA copy numbers in the bone marrow mononuclear cells from patients with leukemia and in ten human leukemic cell lines.Normal marrow samples from the allogeneic stem cell transplantation donors were served as control.Results　The ex[x]pression level of hTERT mRNA was higher in the bone marrow mononuclear cells from 33 FAB(French-American-British，F(xiàn)AB)-M2 patients with AML1/ETO than that from 28 normal donors.The median value was 8.96%(0.23%-76.73%) and 4.20%(0.21%-19.90%)，respectively(P<0.01).The ex[x]pression levels of hTERT mRNA from 47 B-ALL (median value,20.80%;range,0.25%-1566.34%) elevated significantly comparing with that from 156 AML at initial presention(median value,2.06%;range,0-2133.41%) and normal donors (both P<0.001).But it was lower in the bone marrow mononuclear cells from 70 CML(median value,0.57%;range,0-14.77%) and 36 FAB-M3 patients (median value　　0.53%;range,0-11.10%) than that from normal donors (both P<0.01).More over the ex[x]pression median value from 15 patients with acute leukemia at complete remission reduced significantly than that from these patients at initial presention(46.53%,8.96%-218.10% vs. 2.25%,0.18%-45.85%，P<0.001).The ex[x]pression levels of hTERT mRNA vary obviously in ten human leukemic cell lines.Conclusions　The ex[x]pression level of hTERT mRNA is of heterogeneity in the leukemic cells.The up-regulation of the ex[x]pression levels of hTERT mRNA may be one of the factors in the pathogenesis of B-ALL and AML with AML1/ETO.

　　【Key words】　Leukemia;　Reverse transc[x]riptase polymerase chain reaction;　hTERT

　　端粒酶與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在腫瘤等永生化細(xì)胞中，端粒酶活性普遍高于正常組織細(xì)胞。端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白復(fù)合體，其中人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transc[x]riptase，hTERT)是維持端粒酶活性必需的催化亞基，hTERT mRNA表達(dá)水平與端粒酶活性呈良好的正相關(guān)，其表達(dá)上調(diào)將導(dǎo)致端粒酶活性升高，在細(xì)胞的增殖、分化、衰老以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。 在實體腫瘤如胃癌[4]、肺癌[5]及直腸癌[6]中已有較多的報道，并利用該特點用于靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的研究[7-10]。在血液腫瘤方面，國內(nèi)李一榮等[11]曾報道，hTERT mRNA表達(dá)水平與端粒酶活性的上調(diào)是急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)發(fā)生與復(fù)發(fā)的一個重要因素，本文旨在進(jìn)一步應(yīng)用實時定量PCR的方法觀察hTERT在AML、慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukaemia，CML)及急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)中表達(dá)的差異。
　　對象與方法
　　一、研究對象
　　278例患者骨髓標(biāo)本選自2007年3月至2009年9月在北京大學(xué)人民醫(yī)院就診的初診病例，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)FAB(French-American-British)分型標(biāo)準(zhǔn)[12]。包括AML 156例，其中按FAB分型M0 1例，M1 2例，M2 62例，M3 36例， M4 20例，M5 14例，M6 5例，F(xiàn)AB分類不明確的16例; ALL 52例， B-ALL 47例， T-ALL 2例;CML 70例，包括慢性期(chronic phase，CP)56例，加速(accelerated phase，AP)/急變期(blastic phase or blast crisis，BP/BC) 14例。其中15例急性白血病患者收集了治療前及緩解后的標(biāo)本(包括B-ALL 6例、AML 9例)。正常骨髓移植供者28例作為對照組。各類白血病基本臨床特征見表1。
　　10種白血病細(xì)胞系K562、MEG-01、CEM、NB4、HL-60、KG1、Kasumi、Dami、HEL及U937由本所保存，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于RNA提取。表1　白血病患者基本臨床特征
　　二、試驗方法
　　1. RNA提?。核谢颊吖撬杓凹?xì)胞系均提取細(xì)胞RNA。按TRIzol (Invitrogen公司，美國) RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。無菌采集的骨髓標(biāo)本，常規(guī)EDTA抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液(相對密度1.077 g/L)分離出單個核細(xì)胞。分離出的單個核細(xì)胞或培養(yǎng)的各細(xì)胞系細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次后，加入 1 ml TRIzol試劑，劇烈震蕩15 s后室溫放置5 min，加入200 μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻，室溫放置15 min,12 000 g(11 583 r/min) 4 ℃離心15 min后提取上層水相，加入等量異丙醇，-20 ℃保存。使用時，12 000 g(11 583 r/min) 4 ℃離心15 min后，收集沉淀的核酸，用70%的冷乙醇洗滌一次，室溫干燥，加適量的含有RNAsin(400 U/ml)水溶解。在ND-1000分光光度計上檢測其含量及純度(NanoDrop 科技有限責(zé)任公司，美國)，所有用于實時定量RT-PCR的RNA樣本的A260∶A280比率均>1.8。
　　2. RNA反轉(zhuǎn)錄：參照本室常規(guī)進(jìn)行。在20 μl體系中，加入0.25 μg/μl隨機(jī)引物(Promega，U.S.A.),1 U/μl RNAsin(華美生物技術(shù)公司，中國)，10 U/μl Mo-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega，U.S.A.)，每種dNTP 1 mmol/L(Pharmecia，U.S.A.)，后加4 μg RNA(RNA樣品預(yù)先于65 ℃，5 min后，置于冰上待用)。37 ℃反應(yīng)2 h,95 ℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，貯存于-20 ℃ 待用。
　　3. 引物及探針：hTERT 引物和探針序列合成參照文獻(xiàn)[13]，內(nèi)參基因ABL的引物和探針序列合成參照文獻(xiàn)[14]。引物和探針總結(jié)見表2。
　　4. 實時定量PCR檢測hTERT mRNA的表達(dá)水平：hTERT、內(nèi)參基因ABL的擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[13-14]進(jìn)行。制備含ABL cDNA的質(zhì)粒5個系列的稀釋樣本(105、104、103、102、10拷貝)，通過實時定量PCR擴(kuò)增，得到定量評估ABL拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于擴(kuò)增hTERT基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(-3.52)與我們常規(guī)使用的內(nèi)參基因ABL標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(-3.46)相近，為減少實驗的誤差，未知樣品hTERT的拷貝數(shù)參照ABL標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，以hTERT拷貝數(shù)與ABL拷貝數(shù)比值的百分?jǐn)?shù)(hTERT/ABL×)表示hTERT基因的相對表達(dá)水平。
　　實時定量PCR利用ABI 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems，USA) 完成。PCR 條件是 50 ℃，2 min;95 ℃，10 min;接著是95 ℃，15 s;60 ℃，1 min;40 個循環(huán)，PCR 反應(yīng)體系為10 μl，包括1×TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)5 μl,1 μl cDNA,300 nmol/L引物，200 nmol/L(ABL)或150 nmol/L(hTERT)探針。
　　三、統(tǒng)計學(xué)分析

　　統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0軟件。白血病患者與正常人數(shù)據(jù)比較、治療前后數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney U檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)　　果
　　1. 白血病細(xì)胞系hTERT的表達(dá)水平：白血病細(xì)胞系KG1、Kasumi、NB4、HL-60、U937、HEL、Dami、K562、MEG-01及CEM的hTERT mRNA兩次測定的平均水平分別為13.72%、59.31%、0.47%、18.69%、5.39%、4.94%、9.85%、9.36%、1.51%及204.13%。
　　2. AML患者骨髓細(xì)胞hTERT的表達(dá)水平(表3)：156例AML組骨髓細(xì)胞的中位hTERT mRNA水平明顯低于28例正常對照組，但其中AML1/ETO(+)M2 組的hTERT mRNA水平卻明顯高于正常對照組[8.96%(0.23%～76.73%)vs. 4.20% (0.21% ～19.90%)，P=0.008]。其余各AML亞型的hTERT mRNA水平均低于或接近于正常對照組。
　　3. B-ALL骨髓細(xì)胞hTERT的表達(dá)水平：Ph(+)ALL患者骨髓細(xì)胞hTERT mRNA水平高于正常人，中位數(shù)分別為21.49%(0.33%～362.33%)、4.20%(0.21%～19.90%)，約是正常人的5倍(P=0.034)。B-ALL患者骨髓細(xì)胞hTERT mRNA水平明顯高于AML組，中位數(shù)分別為20.80%(0.25%～1566.34%) 和 2.06%(0～2133.41%)(P=0.000)。Ph(+)ALL與Ph(-)ALL相比，hTERT mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.386)。表2　實時定量PCR檢測表3　實時定量PCR檢測hTERT在白血病患者和正常人骨髓細(xì)胞中的表達(dá)水平
　　4. CML骨髓細(xì)胞hTERT的表達(dá)水平(表3)：CML患者h(yuǎn)TERT mRNA水平低于正常人，表達(dá)中位數(shù)分別為0.57%(0～14.77%)、4.20% (0.21%～19.90%)(P=0.000)。初治CML-CP與CML-AP/BC組hTERT mRNA水平相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.860)。
　　5. 治療前后hTERT表達(dá)水平的差異：跟蹤15例初治時hTERT mRNA水平在8.50%(2倍正常對照組中位值)以上的急性白血病，其中B-ALL 6例，AML 9例。結(jié)果如圖1所示，15例患者治療后hTERT mRNA水平明顯下降，中位值由初治時的46.53%(8.96%～218.10%)下降至緩解時的2.25%(0.18%～45.85%)(P=0.000)。
　　討　　論
　　端粒酶是腫瘤細(xì)胞實現(xiàn)永生化的關(guān)鍵酶，在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其活性主要受hTERT調(diào)控，hTERT mRNA的表達(dá)上調(diào)將導(dǎo)致端粒酶活性升高，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。de-Kok等[15]曾對部分正常組織與腫瘤細(xì)胞株的hTERT mRNA進(jìn)行實時定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分正常組織如肺臟、肝臟、胰腺、前列腺、膀胱、腎臟以及腦與尿道不表達(dá)hTERT mRNA，睪丸、骨髓hTERT mRNA 表達(dá)水平較高，而同時檢測的黑色素瘤細(xì)胞株以及膀胱癌hTERT mRNA的表達(dá)水平明顯升高。目前，也有研究表明hTERT的表達(dá)不僅與細(xì)胞的端粒延長及細(xì)胞永生化有關(guān)，而且可通過降低細(xì)胞活性氧簇(ROS)水平使腫瘤細(xì)胞逃避死亡刺激[16]。
　　我們采用實時定量RT-PCR方法對156例初治AML患者骨髓單個核細(xì)胞及28例正常供者的hTERT水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AML初治患者h(yuǎn)TERT的表達(dá)存在較大異質(zhì)性，其總體表達(dá)水平低于正常對照組，這與文獻(xiàn)中對AML病例研究的結(jié)果不符[17-18]，考慮到AML是一組在細(xì)胞和分子遺傳學(xué)上存在高度異質(zhì)性的疾病，我們進(jìn)一步按FAB分型分別分析AML各亞型的hTERT mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AML1/ETO融合基因陽性的M2型AML患者骨髓細(xì)胞中hTERT水平高于正常人水平(中位值約為正常人的2倍)，且高于AML1/ETO陰性的M2及其他AML各亞型患者，提示hTERT的表達(dá)在AML1/ETO基因陽性M2的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。47例B-ALL患者骨髓細(xì)胞hTERT mRNA水平明顯高于正常人，其中位值約為正常人的5倍，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[19-20]。Ph陽性ALL與Ph陰性ALL的hTERT表達(dá)均高于正常對照組，但Ph陽性及陰性組之間差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，15例初治時高表達(dá)hTERT mRNA(大于正常中位值2倍以上)的急性白血病患者，治療后達(dá)到完全緩解時的hTERT mRNA水平明顯下降，與文獻(xiàn)報道的結(jié)果相近。
　　Iwama等[21]曾報道CML-AP/BC患者骨髓細(xì)胞中端粒酶活性明顯升高，而Campbell等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CML-CP及CML-AP/BC患者CD34+ 造血干細(xì)胞的hTERT表達(dá)均明顯下調(diào)。我們的結(jié)果沒有顯示CML-AP/BC與CML-CP患者之間hTERT的表達(dá)存在差異，也沒有發(fā)現(xiàn)CML-AP/BC患者h(yuǎn)TERT的表達(dá)高于正常對照組。這是否與CD34+ 造血干細(xì)胞hTERT表達(dá)降低有關(guān)尚有待于進(jìn)一步研究。
　　我們對人白血病細(xì)胞系進(jìn)行hTERT mRNA水平檢測的結(jié)果也表明，hTERT mRNA在人白血病細(xì)胞中的表達(dá)水平存在異質(zhì)性，在ALL細(xì)胞系CEM中高(204.13%)，在AML1/ETO融合基因陽性的細(xì)胞系Kasumi中其次(59.31%)，在M3細(xì)胞系NB4中低(0.47%)，與臨床AML各亞型相應(yīng)。高表達(dá)hTERT 基因可能激活端粒酶，而端粒酶的激活能使腫瘤細(xì)胞獲得無限增殖的能力，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵性步驟[23]，白血病各型間和同型間hTERT 基因的表達(dá)差異較大，可能反映了個體腫瘤細(xì)胞無限增殖的能力不同，高表達(dá)hTERT mRNA可能是某些白血病如ALL、AML1/ETO陽性的AML發(fā)病機(jī)制中的因素之一。是否與白血病的復(fù)發(fā)、預(yù)后相關(guān)值得進(jìn)一步的研究。
　　志謝　感謝北京大學(xué)人民醫(yī)院血液病研究所同仁在收集標(biāo)本與提供病例資料方面的支持
　　(本文圖片見光盤)

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