膀胱尿路上皮癌組織中TWIST蛋白表達(dá)及其臨床意義

　【摘要】目的：探討TWIST在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征及復(fù)發(fā)的關(guān)系。方法：膀胱尿路上皮癌標(biāo)本65例，正常膀胱組織標(biāo)本8例，采用免疫組織化學(xué)方法檢測兩組標(biāo)本組織中TWIST蛋白的表達(dá)，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果：65例膀胱癌組織和8例正常膀胱組織中TWIST陽性率分別為69.2% (45/65)和0，TWIST蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)水平與患者的年齡、性別及腫瘤的數(shù)目無關(guān)( U 值分別為0.780、1.122、0.810，P>0.05)，但與膀胱癌組織的組織分化程度、腫瘤的分期以及復(fù)發(fā)具有顯著相關(guān)性(U值分別為8.375、3.277、2.255，P<0.05)。隨著膀胱癌細(xì)胞分化越差，浸潤越深，TWIST蛋白染色陽性率逐漸上升，TWIST陽性率升高，提示復(fù)發(fā)風(fēng)險增加。結(jié)論：TWIST蛋白表達(dá)在膀胱癌組織中明顯高于正常組織，TWIST蛋白表達(dá)與膀胱癌的分級、分期、復(fù)發(fā)有關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤數(shù)目無相關(guān)性。檢測TWIST蛋白有助于膀胱癌的診斷與預(yù)后的評估。
　　【關(guān)鍵詞】 膀胱癌;TWIST;免疫組化;預(yù)后

　　[ABSTRACT] ob[x]jective：To explore the ex[x]pression and significance of TWIST in bladder cancer， analyze its correlations with clinicopathologic characters and recurrence of bladder cancer. Methods：The ex[x]pression of TWIST protein in 65 specimens of bladder cancer and 8 specimens of normal bladder tissues was detected by immunohistochemtry， and its correlations to clinicopathologic features was analyzed. Results：TWIST was detected in 59 cases(69.2%) of bladder cancer and zero in the normal bladder tissues. TWIST ex[x]pression had no correlation with age，gender and the number of tumor ( U value were 0.780，1.122，0.810，P>0.05)，while it had significant correlation with degree of tumor differentiation， TMN stage and recurrence( U value were 8.375,3.277,2.255，P<0.05). The severe differentiation was and the deeper infiltration was，the higher positive ex[x]pression of TWIST was. The increase of TWIST positive ex[x]pression indicated higher rate of recurrence.Conclusions：The ex[x]pression of TWIST protein was higher in bladder cancer patients. The positive rate of TWIST protein ex[x]pression is related with tumor differentiation，TMN stage and recurrence，but not with sex，age，tumor number. The detection of TWIST protein ex[x]pression is helpful in diagnosis and prognostic evaluation of bladder cancer.

　　[KEY WORDS] Bladder cancer;TWIST;Immunohistochemistry;Prognosis

　　TWIST是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，屬于堿性的螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)蛋白家族中高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。近的研究表明，TWIST作為上皮-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要影響。本研究采用免疫組化技術(shù)檢測TWIST蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)，探討其與膀胱癌臨床病理因素之間的關(guān)系，為闡明膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及其患者的預(yù)后提供依據(jù)。
　　1　資料與方法
　　1.1　臨床資料

　　本組膀胱尿路上皮癌組織65例，男性53例，女性12例，年齡30～80歲，中位年齡61歲?；颊咝g(shù)前均未接受放、化療(包括膀胱灌注)，且排除原位癌。收集資料包括腫瘤大小、數(shù)目、病理分級、分期(依據(jù)AJCC 2002標(biāo)準(zhǔn))、復(fù)發(fā)情況等。正常膀胱組織8例，均經(jīng)病理證實。
　　1.2　試劑

　　TWIST鼠抗人單克隆抗體(H-81， SC15393)購自Santa Cruz公司，免疫組化染色試劑(SP9002)、DAB顯色液(ZLI-9033)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
　　1.3　檢測方法
　　采用S-P免疫組化法。石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，pH9.0的EDTA緩沖液中經(jīng)高壓鍋抗原修復(fù)，加入10%的胎牛血清37℃孵育，加TWIST單克隆抗體(1∶200稀釋)4℃過夜。加生物素標(biāo)記二抗37℃孵育，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃孵育，DAB染色，蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗做空白對照。
　　1.4　結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

　　TWIST蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)細(xì)胞核中亦有表達(dá)。以細(xì)胞呈清晰棕色或棕褐色為陽性，以細(xì)胞無棕褐色或與背景一致極淡的棕色為陰性。在40倍顯微鏡下觀察整張切片表達(dá)情況，選擇表達(dá)集中的5個視野，換高倍鏡計數(shù)陽性細(xì)胞，計算平均數(shù)。按陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例分級：<5%為-，5%～25%為+,25%～50%為++，>50%為+++。-為陰性，+為低表達(dá)，++～+++為高表達(dá)。
　　1.5　統(tǒng)計學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。TWIST的表達(dá)與各臨床病理因素之間的關(guān)系分別采用Radit分析和χ2檢驗。生存過程描述采用Kaplan-Meier生存曲線法，并進(jìn)行Log-rank檢驗。
　　2　結(jié)果

　　2.1　TWIST在膀胱癌組織和正常組織中的表達(dá)
　　膀胱癌組織中TWIST陽性染色主要位于胞質(zhì)中(圖1、2);65例膀胱癌組織中45例染色陽性，其中+24例，++15例，+++6例，陰性染色20例，陽性率為69.2%,8例膀胱正常黏膜組織中無表達(dá)，腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常膀胱組織(χ2=14.440，P<0.01)?！D1　TWIST在正常組織中　圖2　TWIST在膀胱癌細(xì)未見表達(dá)胞質(zhì)中的表達(dá)
　　2.2　TWIST蛋白的表達(dá)與膀胱癌臨床參數(shù)之間的關(guān)系
　　TWIST蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤的數(shù)目無關(guān)(U值分別為0.780、1.122、0.810，P>0.05)，但與膀胱癌組織的分級、分期以及患者的復(fù)發(fā)情況具有顯著相關(guān)性(U值分別為8.375、3.277、2.255，P<0.05)。隨著膀胱癌組織浸潤深度的加深，TWIST蛋白染色陽性率逐漸上升，TWIST陽性率隨5年復(fù)發(fā)率升高而升高，見表1。表1　TWIST在膀胱癌中的表達(dá)與膀胱癌患者臨床、病理參數(shù)之間的關(guān)系

　　2.3　Kaplan-Meier單變量生存分析
　　TWIST蛋白表達(dá)陽性膀胱癌組織復(fù)發(fā)率較陰性組高(Log-rank檢驗，χ2=4.157，P=0.041)， TWIST蛋白陽性提示復(fù)發(fā)風(fēng)險高，見圖3。圖3　TWIST蛋白陰性組與TWIST蛋白陽性組表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線

　　3　討論

　　TWIST基因是一種在胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，屬于螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族，可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞重建，并賦予細(xì)胞遷移的能力。TWIST在幼稚中胚層細(xì)胞和中胚層起源器官中表達(dá)多，而在出生后降至低水平。新近發(fā)現(xiàn)TWIST具有癌基因的特征，能編碼凋亡抑制蛋白。在浸潤性乳腺癌(浸潤性小葉癌)、彌漫性胃癌等惡性程度高、浸潤性強(qiáng)的腫瘤亞型中可見TWIST表達(dá)，但其表達(dá)強(qiáng)度較幼稚中胚層細(xì)胞和中層起源器官中表達(dá)為弱，但在正常組織和惡性程度低的癌細(xì)胞中并無表達(dá)[1]。一些學(xué)者因此推測TWIST的激活可能是某些惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要因素。
　　TWIST與EMT現(xiàn)象及腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。TWIST促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制在于其能夠使細(xì)胞失去上皮性標(biāo)志如E-鈣粘連蛋白(E-cadherin)，而獲得間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志如波形蛋白(vimetin)和平滑肌肌動蛋白等[3,4]，這使得腫瘤細(xì)胞容易脫離原發(fā)病灶向周圍組織侵襲，并為腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了必要的條件。在絕大多數(shù)惡性腫瘤中，如乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、食管癌、皮膚癌及肺癌等都存在E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞黏附功能的削弱或喪失[3-7]，其共同特征是含有能識別靶基因啟動子上E-box基序的DNA結(jié)合序列[8]。隨著對TWIST研究的深入，TWIST的激活有可能作為腫瘤的預(yù)后因素或者作為腫瘤治療的靶分子[9,10]。
　　本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中TWIST蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常膀胱黏膜組織(P<0.01)，提示TWIST蛋白可為膀胱癌與非癌的鑒別提供參考;同時發(fā)現(xiàn)，膀胱癌細(xì)胞分化越差，浸潤越深， TWIST蛋白陽性細(xì)胞數(shù)越多，染色越深。肌層浸潤性膀胱癌中TWIST表達(dá)明顯高于非肌層浸潤性膀胱癌，提示TWIST在膀胱癌的進(jìn)展中起一定作用。因此，臨床通過檢測TWIST蛋白的表達(dá)，有助于非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌的鑒別診斷。本研究結(jié)果還提示，TWIST蛋白高表達(dá)與患者的術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，為臨床患者術(shù)后復(fù)發(fā)提供了生物學(xué)指標(biāo)。這與劉婷等[11] 對胃癌的研究結(jié)果相同。
　　綜上所述，TWIST蛋白表達(dá)與膀胱癌的病理分級、分期成正相關(guān)，而且TWIST蛋白的表達(dá)也是預(yù)測患者術(shù)后復(fù)發(fā)的一個有效指標(biāo)。TWIST參與膀胱癌的發(fā)生、浸潤、復(fù)發(fā)和預(yù)后的機(jī)制及其與其他相關(guān)基因的關(guān)系如何，是進(jìn)一步研究的重點。
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