槐定堿預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞c-Jun表達(dá)的影響

　　作者：劉靜,張巍,楊峰,黃菱,周婭　　作者單位：寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，銀川 750004

　　【摘要】目的 觀察槐定堿預(yù)處理對(duì)LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞c-Jun表達(dá)的影響，探討槐定堿抗內(nèi)毒素機(jī)制。方法 培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，以槐定堿(31.25mg•L-1)預(yù)處理細(xì)胞24h后給予LPS(E.coli O55:B5)100μg•L-1刺激細(xì)胞，并于刺激后5、30、60、120min收集細(xì)胞;再以槐定堿31.25、15.63、7.81mg•L-1三個(gè)濃度同上預(yù)處理細(xì)胞，于LPS刺激后60min收集細(xì)胞。利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞中c-Jun的表達(dá)。結(jié)果 單獨(dú)槐定堿對(duì)c-Jun表達(dá)無(wú)影響;LPS模型組各時(shí)間點(diǎn)c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著高于巨噬細(xì)胞對(duì)照組(P<0.01)，且隨LPS刺激時(shí)間延長(zhǎng)而升高，持續(xù)升至120min;槐定堿預(yù)處理組在LPS作用后30、60、120min時(shí)c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較同時(shí)間點(diǎn)LPS模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，但槐定堿預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯變化。不同濃度槐定堿(31.25、15.63、7.81 mg•L-1)預(yù)處理細(xì)胞，對(duì)LPS刺激的c-Jun表達(dá)均有顯著抑制作用(均P<0.01)，且31.25 mg•L-1的作用強(qiáng)于另兩個(gè)濃度(15.63、7.81 mg•L-1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論 槐定堿預(yù)處理RAW264.7巨噬細(xì)胞能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的c-Jun蛋白表達(dá)，其作用有劑量依賴性。
　　【關(guān)鍵詞】 槐定堿;LPS;RAW264.7巨噬細(xì)胞株;c-Jun

　　Effects of Sophoridine Pretreating on the ex[x]pression of c-Jun in Macrophage RAW264.7 Induced by LPS

　　(Dept. of Pathogenic Biology and Immunology,Ningxia Med.Univ.,Yinchuan 750004)

　　Abstract: ob[x]jective To explore the anti-endotoxin fuctions and its mechanisms by observing the effects of Sophoridine pretreating on the ex[x]pression of c-Jun in macrophage RAW264.7 induced by LPS.Methods Cultured RAW264.7 cells,using LPS(E.coli O55:B5) at final concentration of 100μg•L-1 to stimulate cell after Sophoridine pretreating cells for 24 hours,and collecting cells at 5min,30min,60min,120min after stimulating;then using Sophoridine (31.25,15.63,7.81mg•L-1) preatreating cells again，and collecting cells at 60 min after LPS stimulating.The ex[x]pression of c-Jun in macrophage RAW264.7 was detected by Immunocytochemistry.Results Single Sophoridine had no effect on the ex[x]pression of c-Jun.The positive cells of c-Jun of LPS model group at each time spot were significantly higher than those of macrophage control group(P<0.01),and the positive cells ascended along with time,reached summit at 120 min.Compared with LPS model group,the positive cells of c-Jun in Sophoridine pretreating group had significantly decreased after LPS stimulating at 30min,60min,120min (all P<0.01),but the number of the positive cells of c-Jun of Sophoridine pretreating groups had no obvious change at each time spot.Different concentration (31.25,15.63,7.81 mg•L-1) Sophoridine pretreating cells had significantly inhibitory action(all P<0.01),and the action of 31.25 mg•L-1 had the advantage over other concentration(15.63,7.81 mg•L-1) (all P<0.05).conclusion Sophoridine pretreating macrophage RAW264.7 can inhibit the ex[x]pression of c-Jun protein induced by LPS,and its action show the dose dependent.

　　Key words:sophoridine; LPS; RAW264.7 Cells; c-Jun

　　細(xì)菌內(nèi)毒素(endotoxin，ET)即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，是G-菌的主要病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP)，巨噬細(xì)胞等通過(guò)模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PRR)結(jié)合PAMPs，導(dǎo)致炎癥失控性表達(dá),對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害。c-Jun蛋白是細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(activator protein-l，AP-1)的主要組分之一，它參與了LPS的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。槐定堿( sophoridine )是豆科槐屬植物苦豆子(Sophora alopecuroides,L)中含量較高的生物堿之一，前期研究發(fā)現(xiàn)槐定堿可顯著減輕內(nèi)毒素肺損傷小鼠的病理?yè)p傷[1]。本文擬進(jìn)一步觀察不同濃度槐定堿預(yù)處理小鼠單核/巨噬細(xì)胞株(RAW264.7)巨噬細(xì)胞，以及LPS刺激槐定堿預(yù)處理細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)c-Jun表達(dá)的變化，以探討槐定堿抗內(nèi)毒素的作用機(jī)制。
　　1 材料與方法
　　1.1 藥品和試劑
　　槐定堿購(gòu)于寧夏藥物研究所，批號(hào):960324，mp 109℃，含量98%以上;RAW264.7來(lái)源于中科院上海細(xì)胞庫(kù);抗小鼠c-Jun多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司;胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司;DMEM為美國(guó)Gibco 公司;胰蛋白酶、LPS(E.coli O55:B5)均系美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品;兔SP檢測(cè)試劑盒、DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋;TritonX-100，北京中山試劑公司。
　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1 藥品配制

　　稱取槐定堿,無(wú)內(nèi)毒素三蒸水溶解，10 N HCl調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4之間，使用前稀釋至所需濃度。稱取LPS,無(wú)內(nèi)毒素三蒸水溶解，使用前旋渦混旋器混旋30min,稀釋至所需濃度。
　　1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

　　培養(yǎng)RAW 264.7巨噬細(xì)胞，待其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。0.25%胰酶消化細(xì)胞，混懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106個(gè)•mL-1。將無(wú)菌蓋玻片放入六孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞懸液，每孔1mL，待細(xì)胞80%融合后分組處理。巨噬細(xì)胞(Mφ)對(duì)照組：無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基孵育細(xì)胞;槐定堿對(duì)照組：含槐定堿31.25mg•L-1培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24h后給予無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基孵育細(xì)胞;LPS模型組：含LPS 100μL•L-1培養(yǎng)基孵育細(xì)胞;槐定堿預(yù)處理組：含槐定堿31.25mg•L-1培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24h后給予含LPS 100μL•L-1培養(yǎng)基孵育細(xì)胞。各組分別給予無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基或含LPS 100μL•L-1培養(yǎng)基孵育細(xì)胞后5、30、60、120min收集細(xì)胞爬片。每個(gè)處理方式重復(fù)3次。觀察槐定堿預(yù)處理對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)c-Jun 表達(dá)的影響。
　　同時(shí)，槐定堿對(duì)照組和槐定堿預(yù)處理組分別用含槐定堿31.25、15.63、7.81mg•L-1三個(gè)濃度的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24h后，分別給予無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基和含LPS 100μL•L-1培養(yǎng)基孵育細(xì)胞60min，收集細(xì)胞爬片。重復(fù)3次。觀察不同濃度槐定堿預(yù)處理對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后c-Jun 表達(dá)的影響。
　　1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)收集各組細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，0.3%TritonX100室溫下30min，3%過(guò)氧化氫室溫10min，5%山羊血清封閉室溫下10min,不洗甩干，加1∶200稀釋的c-Jun一抗(兔抗小鼠c-Jun多克隆抗體)，37℃濕盒內(nèi)120min，加1∶200稀釋的二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG)，37℃濕盒內(nèi)90min，1∶200稀釋的SP(過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素) 37℃濕盒內(nèi)30min，DAB(辣根過(guò)氧化物酶底物顯色劑)室溫下顯色3min，蘇木素復(fù)染3s,依次經(jīng)過(guò)80%、95%、、酒精脫水各1min,二甲苯中透明5min,中性樹膠封片。采集圖像。結(jié)果判定：細(xì)胞核內(nèi)著棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色為陰性細(xì)胞。400×顯微鏡下觀察,每一細(xì)胞爬片隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性百分率 (%)，每組重復(fù)3次。
　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析,組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2 結(jié)果

　　2. 1 槐定堿預(yù)處理對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)c-Jun蛋白表達(dá)的影響
　　結(jié)果表明Mφ對(duì)照組與槐定堿對(duì)照組之間各時(shí)間點(diǎn)c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);LPS模型組各時(shí)間點(diǎn)c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著高于同時(shí)間點(diǎn)Mφ對(duì)照組(χ2=45.239,P=0.000;χ2=281.841,P=0.000;χ2=396.366,P=0.000;χ2=1776.592,P=0.000)，而且c-Jun表達(dá)隨LPS刺激時(shí)間延長(zhǎng)而升高，持續(xù)升至120min?；倍▔A預(yù)處理組，在LPS作用5min時(shí)與LPS模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.13,P=0.077)，在30、60、120min時(shí)槐定堿預(yù)處理組c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較LPS模型組顯著降低(分別為χ2=136.44,P=0.000;χ2=216.42,P=0.000;χ2=1747.59,P=0.000)，但均顯著高于同時(shí)間點(diǎn)Mφ對(duì)照組(分別為χ2=21.57,P=0.000;χ2=29.46,P=0.000;χ2=30.61,P=0.000;χ2=41.69,P=0.000)?；倍▔A抑制LPS誘導(dǎo)的c-Jun表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)與LPS模型組不平行，槐定堿預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均無(wú)明顯變化。結(jié)果見(jiàn)表1，圖1(見(jiàn)封3)。表1 槐定堿對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)c-Jun表達(dá)的影響(略)

　　2.2 不同濃度槐定堿預(yù)處理對(duì)LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞c-Jun蛋白表達(dá)的影響
　　三個(gè)濃度槐定堿(31.25 、15.63 、7.81 mg•L-1)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞，其c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均與Mφ對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為χ2=0.01，P=0.92;χ2=0.02，P=0.90;χ2=0.07，P=0.78),說(shuō)明所用的三個(gè)濃度槐定堿本身均不影響RAW264.7細(xì)胞的c-Jun表達(dá)。三個(gè)濃度槐定堿預(yù)處理組分別用LPS刺激60min后其c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著少于同時(shí)間點(diǎn)LPS模型組(分別為χ2=216.421，P=0.000;χ2=151.519，P=0.000;χ2=133.251，P=0.000)，但均顯著高于Mφ對(duì)照組(分別為χ2=30.61,P=0.000;χ2=90.55,P=0.000;χ2=102.44,P=0.000)。31.25 mg•L-1槐定堿的效應(yīng)與另兩個(gè)濃度(15.63、7.81 mg•L-1)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。表2 同濃度槐定堿對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞c-Jun表達(dá)的影響(略)

　　3 討論

　　近年的研究表明，LPS激活巨噬細(xì)胞表面Toll-like receptors 4(TLR4)后，在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)信號(hào)通路逐級(jí)轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要從兩個(gè)方向分別激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-l，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是其中之一，它普遍存在于多種生物體內(nèi)，是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生的大多數(shù)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄、蛋白生成的下游階段。目前己確定的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有四條[2]，即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、c-Jun N端激酶(JNK)/應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)、p38MAPK和ERK5/BMK1四條通路。其中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino terminal kinase,JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要參與細(xì)胞因子和環(huán)境應(yīng)激，如內(nèi)毒素、炎癥等引起的細(xì)胞反應(yīng)。JNK被LPS激活以后，活化的JNK可磷酸化c-Jun蛋白N-末端并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，c-Jun N末端磷酸化后還可促進(jìn)c-Jun和c-fos異二聚體與同二聚體的形成，這些二聚體可以與許多炎癥因子基因啟動(dòng)子區(qū)的AP-1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)這些基因的轉(zhuǎn)錄活性[3-4]，終促使TNF-а、NO、ICAM-1等炎癥因子的大量失控表達(dá)而致病[5-8]。因此c-Jun是JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游AP-1家族中的一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)分子,LPS刺激細(xì)胞后經(jīng)過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)逐級(jí)放大可引起c-Jun蛋白的變化?！　”緦?shí)驗(yàn)觀察到c-Jun在RAW264.7細(xì)胞核中即有基礎(chǔ)表達(dá)，當(dāng)受到LPS刺激后，RAW264.7細(xì)胞中c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，證實(shí)LPS刺激可以導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)c-Jun的高表達(dá)[9]。本研究所用三個(gè)濃度槐定堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的c-Jun表達(dá)均有抑制效應(yīng)，且其效應(yīng)有劑量依賴性，高濃度(31.25 mg•L-1)效應(yīng)強(qiáng)于中、低濃度，而本研究中三個(gè)濃度槐定堿本身對(duì)RAW264.7細(xì)胞c-Jun表達(dá)均無(wú)影響，說(shuō)明槐定堿預(yù)處理抑制的是LPS誘導(dǎo)的c-Jun表達(dá)，與LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，而對(duì)RAW264.7細(xì)胞的c-Jun基礎(chǔ)表達(dá)無(wú)影響。
　　槐定堿預(yù)孵育細(xì)胞24h后給予LPS刺激，在本研究所設(shè)的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，自5min起c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)開始較同時(shí)間點(diǎn)LPS模型組減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，30min起各時(shí)間點(diǎn)均較同時(shí)間點(diǎn)LPS模型組顯著減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，但均未回復(fù)至Mφ對(duì)照組水平，說(shuō)明槐定堿不能完全抑制LPS誘導(dǎo)的c-Jun表達(dá)，考慮可能與LPS刺激c-Jun表達(dá)的某些通路是槐定堿作用不涉及的有關(guān)。另外，槐定堿作用細(xì)胞后對(duì)LPS誘導(dǎo)的c-Jun表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)與LPS模型組不平行。LPS模型組隨LPS作用時(shí)間延長(zhǎng)，c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增高，持續(xù)升至120min;而槐定堿預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯變化，其時(shí)間效應(yīng)曲線幾乎呈一直線，但均一致性的顯著高于同時(shí)間點(diǎn)Mφ對(duì)照組(P<0.05或 P<0.01)。由此更進(jìn)一步說(shuō)明，槐定堿抑制了部分誘導(dǎo)c-Jun表達(dá)的LPS轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但仍有一些LPS刺激c-Jun表達(dá)的通路不能被槐定堿抑制。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明槐定堿可下調(diào)LPS所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞c-Jun的高表達(dá)，并因此減少炎癥因子表達(dá)，減輕內(nèi)毒素所致炎癥反應(yīng)。但內(nèi)毒素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路復(fù)雜，涉及環(huán)節(jié)眾多，因此確定槐定堿抑制LPS誘導(dǎo)的c-Jun蛋白表達(dá)是作用于c-Jun 還是作用于其上游的某些通路，抑或是多靶點(diǎn)作用，尚須更進(jìn)一步研究。
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