甲型H1N1流感患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)分析

　   甲型H1N1流感是由新型甲型H1N1流感病毒株所引起的一種新型呼吸道傳染病，疫情自2009年3月在墨西哥爆發(fā)，迅速在全球范圍內(nèi)蔓延。該病的傳染性比普通季節(jié)性流感強(qiáng)，高危人群出現(xiàn)流感樣癥狀后，較易發(fā)展為重癥病例[1]，其中部分患者迅速發(fā)展至急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，病死率較高[2]。國(guó)外學(xué)者也認(rèn)為甲型H1N1流感患者的主要死因是ARDS，需要應(yīng)用中小劑量糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療[3-4]。由于激素使用的時(shí)機(jī)和劑量直接影響著患者的預(yù)后，如使用不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致患者自身免疫力受損，進(jìn)而削弱后續(xù)治療的作用，加快病毒復(fù)制，導(dǎo)致不必要的死亡。因此及時(shí)、有效檢測(cè)甲型H1N1流感患者外周血細(xì)胞免疫水平，對(duì)普通季節(jié)性流感和甲型H1N1流感患者的鑒別診斷和指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。
 

　　1　資料與方法
 

　　1.1　一般資料　(1)甲型H1N1流感患者(n=40)：2009年10～11月期間本院急診科收治的經(jīng)咽拭子PCR檢測(cè)陽(yáng)性的臨床確診病例;男性31名，女性9名;平均年齡41歲(18～62歲)。(2)普通季節(jié)性流感患者(n=63)：2010年11～2011年1月就診于本院急診的普通季節(jié)性流感患者;男性39名，女性24名;平均年齡56歲(18～86歲);部分患者僅表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)熱等一般流感癥狀，部分患者有肺炎表現(xiàn)。(3)健康對(duì)照組(n=20)：2010年11～12月來(lái)本院進(jìn)行健康體檢者，選取與上述兩組患者年齡、性別相匹配者;男性11名，女性9名;平均年齡45歲(18～84歲)。
 

　　1.2　方法
 

　　1.2.1　標(biāo)本制備　8h內(nèi)采集的乙二胺四乙酸三鉀抗凝的新鮮血液。采血后立即顛倒混勻數(shù)次，將血液與抗凝劑混勻，以防止凝固，并于室溫保存。
 

　　1.2.2　主要試劑和儀器　三色標(biāo)記的抗體試劑盒MultiT-EST[含單抗CD3FITC/CD8PE/CD4PerCP和FACS(10×)溶血素)]和計(jì)數(shù)管購(gòu)于美國(guó)BD公司。FACSCalibur流式細(xì)胞儀也購(gòu)自美國(guó)BD公司，配有635nm和488nm激光管，并能檢測(cè)前向及側(cè)向角。應(yīng)用CaliBRITETM磁珠及FAC-SCompTM軟件校準(zhǔn)儀器，MultiSETTM軟件獲取及自動(dòng)分析檢測(cè)結(jié)果。
 

　　1.2.3　抗體標(biāo)記　取20μLMultiTEST試劑置于計(jì)數(shù)管底，加入50μL充分混勻的抗凝全血，在避光、室溫的環(huán)境下孵育15min后加入45μL1×FACS溶血素，再次孵育。標(biāo)本于24h內(nèi)上機(jī)分析。
 

　　1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s表示，三組間兩兩比較采用方差分析，以p< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
 

　　2　結(jié)果
        甲型H1N1流感患者CD3+T細(xì)胞水平明顯低于普通季節(jié)性流感患者(p=0.001)和健康對(duì)照組(p=0.001)，普通季節(jié)性流感患者CD3+T細(xì)胞水平也明顯低于健康對(duì)照組(p=0.019)。甲型H1N1流感患者CD4+T細(xì)胞明顯低于普通季節(jié)性流感患者(p=0.001)和健康對(duì)照組(p=0.001)，普通季節(jié)性流感患者CD4+T細(xì)胞明顯低于健康對(duì)照組(p=0.008)。甲型H1N1流感患者CD8+T細(xì)胞顯著低于普通季節(jié)性流感患者(p=0.020)和健康對(duì)照組(p=0.001)，普通季節(jié)性流感患者CD8+T細(xì)胞與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.052)。見(jiàn)表1。

　　3　討論
        甲型H1N1流感與普通季節(jié)性流感在致病性上存在差異，它更易侵犯下呼吸道和肺泡，從而導(dǎo)致急性的肺損傷，造成嚴(yán)重的并發(fā)癥，病情的輕重可能與免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱密切相關(guān)[5]。機(jī)體內(nèi)的CD3+T細(xì)胞水平反映成熟的總淋巴細(xì)胞水平，其主要包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。正常情況下淋巴細(xì)胞亞群之間相互協(xié)調(diào)、相互平衡，使機(jī)體處于免疫穩(wěn)定狀態(tài)，可抵抗外界病原體的入侵。因此，T淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗病毒感染中起關(guān)鍵作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)甲型H1N1流感患者外周血T淋巴細(xì)胞各亞群均明顯低于普通季節(jié)性流感患者和健康對(duì)照組，這可能是因?yàn)榧仔虷1N1流感病毒具有嗜淋巴細(xì)胞特異性，可以在淋巴細(xì)胞內(nèi)繁殖復(fù)制，可能導(dǎo)致大量淋巴細(xì)胞的破壞，從而使患者外周血CD3+T、CD4+T和CD8+T細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞免疫功能下降[7-9]。綜上所述，甲型H1N1流感患者的淋巴細(xì)胞及亞群均受到不同程度的損傷，造成免疫功能減低。外周血淋巴細(xì)胞及各亞群的檢測(cè)對(duì)于判斷甲型H1N1流感感染患者免疫功能的改變有重要意義，且有助于與普通季節(jié)性流感進(jìn)行鑒別診斷并指導(dǎo)臨床用藥。

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　　[8]張永臣，趙偉，王念躍.甲型H1N1流感患者治療前后外周血淋巴細(xì)胞與T細(xì)胞亞群的變化[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2010：22(5)：386-387.
[9]陳穎，王軍.重癥甲型H1N1流感患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化的臨床意義探討[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011：5(2)：140-143.
　　(收稿日期：2013-12-15)