微小RNA-143抑制人腎癌細(xì)胞株A498增殖及其對(duì)凋亡的影響

　　近期研究結(jié)果顯示,一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA,其大小長(zhǎng)20一25個(gè)核昔酸,簡(jiǎn)稱微小RNA(miRNA),miRNA通過與其靶mRNA的端非翻譯區(qū)結(jié)合實(shí)現(xiàn)靶mRN;}降解或翻譯抑制的作用,從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)調(diào)控的作用,廣泛參與多種生物學(xué)進(jìn)程如增殖、分化、凋亡等廠’目前關(guān)于miR-143在腎癌中的表達(dá)及作用的研究報(bào)道尚少_我們通過化學(xué)合成miR-143模擬物,觀察其對(duì)腎癌細(xì)胞株X498增殖及凋亡的影響.
　　材料與方法 　　
　　1.材料:人腎癌細(xì)胞株A498購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所,Opti-MEMI轉(zhuǎn)染用無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自Cil>c<,公司,miR-143mimic及轉(zhuǎn)染指示劑購(gòu)自廣州銳博科技有限公司,Lipofectamine 2000(簡(jiǎn)稱Lipo2000)購(gòu)白美國(guó)Invitrogen公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)試劑盒、胎牛血清(FBS),RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自碧云天生物公司,膜聯(lián)蛋白`l一異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司.
　　2.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:A498細(xì)胞株采用含10%FBS,100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI164.培養(yǎng)液在37}C,501cCOZ條件下培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,轉(zhuǎn)染前241;將細(xì)胞1:2傳代于6孔板中,以不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80}}e-90%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染.按照Lipofectamine2000使用說明轉(zhuǎn)染miR-143mimics及對(duì)照序列,實(shí)驗(yàn)分為3組:miR-143mimics轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組(I\C組)、空白對(duì)照組(Opti-MEMI無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的A498細(xì)胞)miR-143mimics和轉(zhuǎn)染對(duì)照序列用量為60nmol/L;同時(shí)轉(zhuǎn)染F.}M標(biāo)記的陰性對(duì)照為60nmol.}L轉(zhuǎn)染24h后熒光顯微鏡(Olympus公司)下觀察并評(píng)估轉(zhuǎn)染效率,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).
　　3.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:細(xì)胞轉(zhuǎn)染6h居,}6孔板消化,洗滌、離心、混勻后計(jì)數(shù)2x10個(gè)接種于96孔板中,每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)復(fù)孔,另設(shè)6孔空白對(duì)照用于去除背景,繼續(xù)培養(yǎng)至24,48,72,96h,每孔加入IO閃CCK-8試劑,繼續(xù)孵育1h,酶標(biāo)儀(Labsvstem公司)測(cè)定490nm處各孔吸光度(Aa9o)值,扣除背景后,作出細(xì)胞增殖曲線,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次4..}nnexin`'-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,按方法2中分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,轉(zhuǎn)染48h后,消化收集細(xì)胞并用400目濾網(wǎng)過濾,制備濃度1x100/L單細(xì)胞懸液.磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,用200閃1x結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸,取100},1細(xì)胞重懸液加入5N.,1Annexin}-FITC和5}l碘化丙錠(PI標(biāo)記,避光室溫反應(yīng)15min,再加人400}.ilx結(jié)合緩沖液,Ih內(nèi)上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋L_率,結(jié)果取平均值.
　　

　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x1.s)表示,采用Student'st檢驗(yàn)和方差分析,兩兩比較采用LSD法結(jié)果1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè):X498細(xì)胞轉(zhuǎn)染F_}11轉(zhuǎn)染指示劑對(duì)照序列24h后,熒光顯微鏡下觀察熒光分布,可見80%以上的細(xì)胞內(nèi)有熒光分布,轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上2.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖:從圖1結(jié)果叮見,轉(zhuǎn)染后24,48,72,96h與空白對(duì)照組比較,>yC組細(xì)胞增長(zhǎng)未見抑制,而,niR-143mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖則明顯抑制,抑制效應(yīng)在轉(zhuǎn)染48h后顯現(xiàn),并持續(xù)48h以上(P<0.O5).
　　3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-143mimics后A498凋亡結(jié)果:miR-143mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為(9.10士2.31)%,顯著高于NC組〔(4.23士1.52>%.與空白討照組}13.4311.61)%,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義{P<0.O5).
　　討論
　　目前已發(fā)現(xiàn)多種miR1}A與腫瘤關(guān)系密切,如miR-155,miR-200c,miRNA-518h等[?-3,部分小分子RNA可作為腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)志分子例如let-7,miR-16等,對(duì)確定治療方案有重要作用"1TI1R}'A可能通過調(diào)控多種分子通路參與腎癌的發(fā)生,如細(xì)胞增殖、凋亡逃逸、血管生成等?J.本研究通過化學(xué)合成miR-143mimics,并將其轉(zhuǎn)染至人腎癌細(xì)抱株A498中,檢測(cè)其對(duì)腎癌細(xì)胞增殖及凋亡的影咽,發(fā)現(xiàn)其具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的作用一提示小分子miR-143可能為腎癌的潛在治療靶點(diǎn),其具體的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究.
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