帶狀皰疹相關(guān)性疼痛患者外周血中Th17細胞及轉(zhuǎn)錄因子的變化 A

帶狀皰疹( herpes zoster，HZ)由潛伏在感覺神經(jīng)元內(nèi)的 水痘一帶狀皰疹病毒再激活，臨床表現(xiàn)為按單側(cè)神經(jīng)節(jié)段分布的局部皮膚區(qū)域出現(xiàn)皰疹或伴疼痛。目前關(guān)于帶狀皰疹相關(guān)性疼痛的機制尚不明確。研究表明輔助性T細胞( helper T cells，Th)在相關(guān)性疼痛中起著重要的作用[l]。 輔助性T細胞17( helper T17 cells，Th17)細胞是一種新型研究的Th細胞。目前關(guān)于Th17細胞及轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤獨受體yt( retinoic acid receptor related orphan receptor， ROR yt)以及信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transc[x]ription 3，STAT3)的研究主要涉及在過敏性疾病、哮喘、心血管疾病，炎性疾病如炎性反應(yīng)性腸病等[2]。 關(guān)于帶狀皰疹相關(guān)性疼痛中Th17細胞及轉(zhuǎn)錄因子的研 究較少，本研究旨在探討Th17細胞及轉(zhuǎn)錄因子ROR yt和 STAT3在帶狀皰疹相關(guān)性疼痛中的變化及意義。

1材料與方法

1.1材料
1.1.1 主要試劑：淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；Anti-IL17-PE抗體、Anti-CD4-FITC抗體和 Anti-CD3 -APC抗體（Bioscience公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(In-vitrogen公司)；PCR引物合成由英俊公司合成。

1.1.2研究對象：此研究經(jīng)華中科技大學同濟醫(yī)學院倫理委員會批準，并取得所有涉及此項研究患者和正常人的同意。自2014年6月至2015年12月在武漢協(xié)和醫(yī)院皮膚科、疼痛科門診及病房選擇符合帶狀皰疹相關(guān)性疼痛的患者共20例，根據(jù)患者皮損出現(xiàn)后疼痛持續(xù)時間分為帶狀皰疹(HZ)性神經(jīng)痛組10例；帶狀皰疹后神經(jīng)痛(post-herpetic neuralgia，PHN)組10例。入選標準：符合HZ及PHN的診斷標準，所有患者選取年齡在50~70歲，疼痛部位位于軀干部。對照組為健康體檢者10名，均來自體檢中心。3組均無免疫系統(tǒng)疾病、嚴重的中樞系統(tǒng)并發(fā)癥、感染性疾病疾患者、過敏性疾病及心血管疾病者。

1.2方法
1.2.1 標本采集：于清晨采集空腹EDTA抗凝外周靜脈血5mL。

1.2.2密度梯度離心法分離血液單個核細胞( PBMC)：將采集的EDTA外周靜脈抗凝血離心去上層血清后，使用PBS稀釋并轉(zhuǎn)移到含淋巴細胞分離液上，按照密度梯度離心法獲得PBMC。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測Th17細胞比例：調(diào)整細胞濃度并取1×l06個/mL，離心并重懸于100μL的PBS中，加入5LLL對應(yīng)的CD3 -APC和CD4 -FITC抗體，常溫避光孵育30min，PBS洗滌2次。固定，離心，棄上清液后，加入100μL破膜劑重懸細胞。加入5μL的IL-17A-PE抗體，常溫 避光孵育30 min，加入2 mL破膜劑，1200 r/min離心洗滌2次，棄上清液，細胞重懸于PBS（含1% BSA），行流式細胞儀檢測。流式細胞儀調(diào)節(jié)FSC、ssc及電壓，根據(jù)抗體所標熒光素調(diào)節(jié)熒光補償并進行設(shè)置門。使用CELLQuest軟件進行檢測和分析流式細胞術(shù)檢測各組PBMC中Th17細胞的百分比。

1.2.4RT-qPCR檢測PBMC中Th17細胞的轉(zhuǎn)錄因子STAT3以及RORyt的基因mRNA的表達：PBMC總RNA提取后，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于- 20℃保存?zhèn)溆没蛐蠵CR。本實驗反應(yīng)條件為95℃10min變性，95℃10 s、60℃20 s以及72℃20s共40個循環(huán)，與內(nèi)參基因3-actin和對照組比較得出擴增倍數(shù)，采用2- AACt法進行分析。ROR一yt引物序列：正義序列：5，_CCTTTACCTGGGGT CTAACCAA-3’，反義序列：5’-GTGCCACCCCCTAAACTCT-3’；STAT3引物序列：正義序列：5’CCTTTGGAACGAAGGGTACA-3’，反義序列：5’一CGCACTGGATCTGGGTCTTA-3’；內(nèi)參3-actin引物序列：正義序列：5’-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3’；反義序歹0:5’-CGCGGCGATATCATCATCC-3’。

1.3統(tǒng)計學分析：應(yīng)用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，計量資料 以均數(shù)±標準(i±s)差表示；3組間整體比較采用非參數(shù)檢驗的k Independent Samples。不同指標間的相關(guān)性分析 非正態(tài)分布用Spearman分析，正態(tài)分布用Pearson分析。

2結(jié)果
2.1各組Th17百分比比較：HZ組及PHN組Th17細胞百分比較對照組有所增加，HZ組高于PHN組（P<0.05）（表1）。