運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因表達(dá)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）是一種在微生物發(fā)酵工程中非常具有前景的底盤細(xì)胞。為了在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)外源基因表達(dá)的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控，本團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了由四環(huán)素（Tetracycline, Tc）與阿拉伯糖（Arabinose, Ara）共同誘導(dǎo)的T7 RNA聚合酶，以及含有T7啟動(dòng)子的pTZ系列穿梭表達(dá)質(zhì)粒（運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌-大腸桿菌），成功建立了表達(dá)效率高、正交性強(qiáng)的T7表達(dá)系統(tǒng)，我們也利用該系統(tǒng)測(cè)試了數(shù)種外源蛋白的表達(dá)水平。

同時(shí)，我們選取具備自動(dòng)分泌特性的超折疊綠色熒光蛋白(sfGFP, superfold GFP)測(cè)試其在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的分泌能力，可以與上述建立的系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)異源蛋白的高效表達(dá)與一步分泌。

項(xiàng)目背景

基因表達(dá)調(diào)控是一個(gè)具有多層次性和復(fù)雜性的過程，包括基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平等多個(gè)層次。對(duì)于原核生物而言，其調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)過程緩慢、效率低，缺乏誘導(dǎo)特異性和表達(dá)的精確調(diào)控等，限制了表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。故而期望出現(xiàn)更豐富的基因嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控系統(tǒng)，使基因的時(shí)空表達(dá)受到高效的嚴(yán)謹(jǐn)控制，有效使用細(xì)胞的資源。 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，是目前已知通過Entner-Doudoroff（ED）途徑進(jìn)行厭氧發(fā)酵的微生物，具有基因組小，乙醇產(chǎn)率高，耐受高糖、高酒精，生長(zhǎng)溫度（24～45℃）和pH（4.0～8.0）范圍廣泛等優(yōu)良特性。由于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的這些特性，使得它在工業(yè)化生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)也有針對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌開展的大量系統(tǒng)與合成生物學(xué)、基因工程與代謝工程等方面的研究成果。

大腸桿菌中高效表達(dá)的T7 RNA聚合酶（T7 RNAP, T7P）系統(tǒng)已有報(bào)道，我們嘗試在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中設(shè)計(jì)類似的高效表達(dá)系統(tǒng)，用于嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控線路的構(gòu)建，幫助解析有毒基因的功能及實(shí)現(xiàn)代謝途徑在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控；同時(shí)也將構(gòu)建可以在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌與大腸桿菌中使用的穿梭質(zhì)粒，方便質(zhì)粒的構(gòu)建及提高外源基因在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的表達(dá)效率，為后續(xù)蛋白的表達(dá)與分泌及代謝工程途徑優(yōu)化調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

項(xiàng)目技術(shù)線

通過構(gòu)建四環(huán)素與阿拉伯糖共同誘導(dǎo)表達(dá)T7 RNA聚合酶的穿梭載體，實(shí)現(xiàn)具有強(qiáng)正交性T7表達(dá)系統(tǒng)在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的建立：T7 RNAP具備一定的毒性，所以對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控：T7 RNAP由啟動(dòng)子PBAD控制，同時(shí)AraC的表達(dá)又受到Ptet調(diào)控。在沒有添加阿拉伯糖誘導(dǎo)物的條件下，目的蛋白GFP沒有表達(dá)或者表達(dá)量很低；在四環(huán)素和阿拉伯糖兩種誘導(dǎo)物同時(shí)存在的時(shí)候蛋白表達(dá)量高。     基于pET系列質(zhì)粒，通過添加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的復(fù)制子構(gòu)建有 PT7 驅(qū)動(dòng)的外源基因表達(dá)的pTZ系列質(zhì)粒：后續(xù)可以將帶有待表達(dá)蛋白基因的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pTZ轉(zhuǎn)入已建立T7表達(dá)系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，實(shí)現(xiàn)基因與線路的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控與蛋白的高效表達(dá)。

主要成果

?設(shè)計(jì)T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒并構(gòu)建轉(zhuǎn)化菌株。

?檢驗(yàn)雙質(zhì)粒系統(tǒng)蛋白表達(dá)效果。

我們選用綠色熒光蛋白GFP作為報(bào)告蛋白，相應(yīng)的基因克隆到含有PT7啟動(dòng)子的pTZ22b和pTZ28a空載體上；同時(shí)將該基因克隆到不含PT7啟動(dòng)子的pEZ15A空載體上作為對(duì)照組。將含上述報(bào)告基因的3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到重組菌株ZM-1（p39-Ptet-AraC-PBAD-T7P）中。

得到的轉(zhuǎn)化菌株都含有T7 RNA聚合酶質(zhì)粒和報(bào)告基因質(zhì)粒。

我們采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同菌株內(nèi)GFP的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同濃度梯度的四環(huán)素（Tc）、阿拉伯糖（Ara）誘導(dǎo)下，PT7驅(qū)動(dòng)的表達(dá)質(zhì)粒pTZ22b-GFP、pTZ28a-GFP能夠響應(yīng)Tc或Ara的誘導(dǎo)，且具有劑量依賴性；而不含PT7的對(duì)照質(zhì)粒pEZ15A-GFP不受到Tc或Ara的誘導(dǎo)調(diào)控。

用0.8 μg/mL的四環(huán)素和3 mg/mL阿拉伯糖組合進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，報(bào)告基因的熒光值高。可見，雙質(zhì)粒系統(tǒng)確實(shí)可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的嚴(yán)謹(jǐn)控制，并且也初步實(shí)現(xiàn)了外源基因的大量表。

?分泌蛋白的檢驗(yàn)。

選取3個(gè)GFP突變株：sfGFP7、sfGFP15、GFP-high，將以上3個(gè)基因克隆到pEZ15A空載體上，并分別轉(zhuǎn)化到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，測(cè)試其單在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌內(nèi)單獨(dú)表達(dá)時(shí)的表達(dá)量以及分泌能力。

通過Western Blot檢測(cè)不同的GFP在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的分泌情況：將3個(gè)得到的轉(zhuǎn)化菌株菌培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后，取定量的上清進(jìn)行檢測(cè)。

我們采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3個(gè)GFP突變株的熒光強(qiáng)度，同時(shí)，取定量上清通過Western Blot檢測(cè)不同的突變體的分泌情況。結(jié)果表明，突變株GFP-high的總體熒光強(qiáng)度低于另外兩突變株，上清中也未得到相應(yīng)熒光蛋白，而突變株sfGFP7及突變株sfGFP15在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的表達(dá)量及分泌能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于突變株GFP-high，其中突變株sfGFP15的熒光強(qiáng)度高，且分泌能力強(qiáng)。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)將以上述GFP為載體，從多肽到異源的復(fù)合蛋白，分別與其進(jìn)行融合表達(dá)，確定其是否具備攜帶融合蛋白自動(dòng)分泌的特性；除了促進(jìn)細(xì)胞外分泌，也需確定sfGFP融合蛋白是否可以正確折疊成活性復(fù)合蛋白結(jié)構(gòu)。