紫杉醇脂質(zhì)體節(jié)奏性化療對(duì)胃癌乏氧影響的實(shí)驗(yàn)研究

【摘要】  ［目的］ 利用乏氧顯像監(jiān)測(cè)紫杉醇脂質(zhì)體節(jié)奏性化療過(guò)程中胃癌的乏氧變化。［方法］36只荷人胃癌HS-746T細(xì)胞的雄性裸鼠（4~6周）隨機(jī)分成兩組，治療組按5mg/kg的劑量每3天一次行腹腔內(nèi)注射紫杉醇脂質(zhì)體，對(duì)照組注射同體積的生理鹽水。治療后第2d和14d利用SPECT全身靜態(tài)掃描顯示注射99mTc-HL91后5，10，15，30，60，120和180min的顯像。在顯像上標(biāo)記感興趣區(qū)為靶點(diǎn)，計(jì)算各組靶/非靶比值。然后處死裸鼠、切下腫瘤行稱重和放射性計(jì)數(shù)。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CD34表達(dá)，計(jì)算腫瘤微血管密度（MVD）。 ［結(jié)果］ 治療后第2d，紫杉醇脂質(zhì)體治療組T/NT低于對(duì)照組（7.82±0.28 vs. 9.56±0.31，P<0.05），離體腫瘤放射性滯留降低（0.71±0.03 vs. 0.97±0.03，P<0.05），MVD降低（42.89±2.63 vs. 52.78±3.09，P<0.05）；治療后第14d，治療組T/NT高于對(duì)照組（11.54±0.42 vs. 9.96±0.28，P<0.05），離體腫瘤放射性滯留升高（1.42±0.05 vs. 11.54±0.42，P<0.05），MVD明顯降低（27.89±2.51 vs. 66.11±2.83，P<0.001）。 ［結(jié)論］ 治療初期紫杉醇脂質(zhì)體降低胃癌乏氧，后期乏氧增加，乏氧監(jiān)測(cè)對(duì)胃癌的治療有一定的指導(dǎo)意義。

【關(guān)鍵詞】  胃癌細(xì)胞

    Experimental Study of Effects of Metronomic Chemotherapy with Paclitaxel-Liposomes on Gastric Cancer Hypoxia

    ZHENG Yong-bin, TONG Shi-lun, HE Jie, et al.

    (Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China)

    Abstract:  ［Purpose］ To monitor the hypoxic change of gastric cancer during metronomic chemotherapy with paclitaxel-liposomes by the hypoxia imaging.  ［Methods］ Thirty-six male nude mice bearing human gastric cancer HS-746T cells were randomly divided into two groups: The treatment group received paclitaxel-liposomes at a dose of 5mg/kg intraperitoneally and control group received the same volume of saline in every three days. On 2 and 14 days, all the mice underwent static whole body planar imaging with SPECT at 5, 10, 15, 30, 60, 120 and 180 minutes after injection of 99mTc-HL91. Region of interest, ROI were drawn as the target in planar imagines and target-to-non targeted (T/NT) were calculated. Then the mice were sacrificed and the tumors were removed, weighted and the radioactivities were measured. CD34 ex[x]pressions were detected by immunohistochemical staining and microvascular densities (MVD) of the tumors were calculated. ［Results］ On  the second days after paclitaxel-liposomes treatment, T/NT ratio of treatment group was significantly lesser than that of control group（7.82±0.28 vs. 9.56±0.31, P<0.05）, the radioactive retention and the MVDs of isolated tumor tissues in the treatment group were lesser than those of control （0.71±0.03 vs. 0.97±0.03,P<0.05） （42.89±2.63 vs. 52.78±3.09,P<0.05）. On 14 days after treatment, T/NT ratio and the radioactive retention of treatment group were significantly higher than those of control group （11.54±0.42 vs. 9.96±0.28,P<0.05） （1.42±0.05 vs. 11.54±0.42,P<0.05）. The MVD of isolated tumor tissues in the treatment group was significantly lesser than that in control（27.89±2.51 vs. 66.11±2.83,P<0.001）. ［Conclusion］ In the early stage of the treatment, paclitaxel-liposomes decrease the hypoxia of gastric cancer and in the late stage of treatment which increases the tumor hypoxia. Therefore, detection tumor hypoxia may be important in guiding the treatment for gastric cancer.

    Key words: 99mTc-HL91; paclitaxel-liposomes; tumor hypoxia; nude mice

    多數(shù)實(shí)體瘤中存在不同程度的乏氧細(xì)胞，乏氧是腫瘤異質(zhì)性的重要特征。實(shí)驗(yàn)及臨床數(shù)據(jù)顯示乏氧不僅是導(dǎo)致放療失敗和化療耐受的重要原因，而且使腫瘤具有侵襲性，易發(fā)生治療后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，為腫瘤治療帶來(lái)很大困難。我們?cè)诤扇宋赴┘?xì)胞(HS-746T)的裸鼠異種移植模型上，研究了紫杉醇脂質(zhì)體治療后胃癌的乏氧變化。

    1   材料與方法

    1.1   試   劑

    RPMI-1640培養(yǎng)液和胰酶購(gòu)于Gibco公司， HS-746T細(xì)胞系來(lái)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心，紫杉醇脂質(zhì)體（力撲素）由南京思科藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)。

    1.2   顯像劑制備

    HL91藥盒由北京欣科思達(dá)醫(yī)藥科技有限公司提供。99mTc-HL91標(biāo)記方法：取HL91凍干品1支，加入約925MBq（2ml）新鮮99mTc淋洗液，使其全部溶解，室溫放置10min即可。采用雙體系展開測(cè)定放化純度：①新華一號(hào)濾紙，甲醇為展開劑。②硅膠G層析板：生理鹽水為展開劑，標(biāo)記率>90%。

    1.3   主要儀器

    美國(guó)GE公司的 Discovery VH型符合線路SPECT，配置針孔準(zhǔn)直器。科大創(chuàng)新股份有限公司的GC-1200γ放射免疫計(jì)數(shù)器。

    1.4   實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    4～6周齡雄性裸鼠Balb/c 36只，體重18g～20g，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并在該中心SPF（specific pathogen free）條件下飼養(yǎng)。

    1.5   實(shí)驗(yàn)方法

    1.5.1   人HS-746T細(xì)胞培養(yǎng)與單細(xì)胞懸液的制備

    含10%小牛血清的RPMI-1640，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)，每1～2d換液1次，3～4d后可長(zhǎng)成單層細(xì)胞，每3d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，生理鹽水配制成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)（trypan blue）染色，活細(xì)胞＞95%，生理鹽水將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×108/ml。

    1.5.2   荷人HS-746T細(xì)胞的裸鼠異種移植模型的建立及治療方法

    裸鼠雙前肢皮下分別用1ml的微量注射器，注射HS-746T單細(xì)胞懸液200μl，2周后，腫瘤長(zhǎng)徑至2mm～5mm時(shí)，隨機(jī)將裸鼠分成4組（每組n=9）：1、3為治療組，按5mg/kg腹腔注射紫杉醇脂質(zhì)體，2、4為對(duì)照組，腹腔注射同體積的生理鹽水；兩組均為每3天注射1次，連續(xù)使用2周。1、2組于初次治療后第2d，3、4組于治療后第14d測(cè)量腫瘤乏氧和微血管密度（MVD）。

    1.5.3   99mTc-HL91荷瘤裸鼠全身顯像

    裸鼠腹腔注射20%烏拉坦(800mg/kg～1 000mg/kg)麻醉，仰臥固定，經(jīng)尾靜脈注射99mTc-HL91 37MBq(1mCi)，以SPECT GE Millenium VG儀采集注射后5min、10min、15min、30min、1h、2h、3h荷瘤裸鼠全身靜態(tài)后位平面圖像。采集條件：針孔準(zhǔn)直器，256×256 矩陣，放大倍數(shù)4.0，采集時(shí)間10min。在荷瘤裸鼠99mTc-HL91顯像圖像上勾畫腫瘤和下肢的感興趣區(qū)（ROI），測(cè)量各ROI內(nèi)平均放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算出靶和非靶組織放射性比值(T/NT)。取3h的顯影的T/NT比值代表組織乏氧狀態(tài)，測(cè)定各組腫瘤的乏氧情況。離體腫瘤組織放射性分析：裸鼠全身乏氧顯像3h后處死裸鼠，剝離腫瘤組織，稱重，測(cè)量放射性計(jì)數(shù)[1]。

    1.5.4   免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判斷

    腫瘤組織于10%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片（4μm），CD34免疫組織化學(xué)染色。采用S-P法，按試劑盒說(shuō)明逐步操作。各組標(biāo)本同一批染色，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。按照Weidner[2]標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算MVD。

    1.6   統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS10.0，所有數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用方差分析。

    2   結(jié)   果

    2.1   乏氧測(cè)定

    荷瘤裸鼠注射99mTc-HL91后自5min起腫瘤部位放射性增高，顯影開始清晰，對(duì)照組腫瘤于3h顯影更為明顯,與周圍組織有較高的對(duì)比度（圖1）；治療后第2d，3h顯影治療組T/NT比值和腫瘤的放射性滯留時(shí)間低于對(duì)照組；而治療后在第14d治療組T/NT比值和腫瘤的放射性滯留時(shí)間高于對(duì)照組（P<0.05）（表1）。

    2.2   瘤重和MVD

    治療后第2d治療組和對(duì)照組的瘤重?zé)o明顯區(qū)別，第14d治療組腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制，瘤重明顯低于對(duì)照組。CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，所有腫瘤組織均有陽(yáng)性表達(dá)（圖2），內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色，微血管有的形成管腔，有的僅為單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，腫瘤邊緣組織的MVD高于中央。治療后第2d治療組瘤組織中MVD少于對(duì)照組（42.89±2.63 vs. 52.78±3.09，P<0.05)。治療后第14d治療組瘤組織中MVD明顯少于對(duì)照組（27.89±2.51 vs. 66.11±2.83，P<0.01）和第2d治療組（27.89±2.51 vs. 42.89±2.63，P<0.01）。

    3   討   論

    紫杉醇是一種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其藥用溶媒聚氧乙基代蓖麻油進(jìn)入體內(nèi)后有可能引起危及生命的超敏反應(yīng)，為減少該反應(yīng)的發(fā)生，我們應(yīng)用紫杉醇脂質(zhì)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，脂質(zhì)體作為載體具有降低毒性，減輕變態(tài)反應(yīng)和免疫反應(yīng)等特點(diǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示裸鼠對(duì)紫杉醇脂質(zhì)體耐受良好，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)出現(xiàn)。

    紫杉醇除了對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用外，同時(shí)也是一種特異性內(nèi)皮細(xì)胞遷移抑制劑，能抑制腫瘤的血管生成，特別是通過(guò)節(jié)奏性給藥的方式能顯著導(dǎo)致腫瘤局部缺血、缺氧，引起腫瘤組織壞死[4]，但其是否將進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤乏氧尚不得而知。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，紫杉醇治療后第2d腫瘤乏氧降低，第14d乏氧明顯增高，提示紫杉醇治療后腫瘤的乏氧變化并不固定。該觀察結(jié)果與先前國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究結(jié)論相符合。如Webb等[5]觀察了在DC101治療后腫瘤乏氧的變化情況，發(fā)現(xiàn)第2d乏氧減少，在第5d幾乎完全消失，在第8d再次增加； Ansiaux等[6]監(jiān)測(cè)了抗血管生成治療后1～5d內(nèi)的腫瘤組織氧合的動(dòng)態(tài)變化曲線，同樣發(fā)現(xiàn)其為先降低后增加。Jain[7]為解釋該現(xiàn)象提出了“腫瘤血管正常化窗口”的假設(shè)，某些抗腫瘤血管生成劑能暫時(shí)“正?；?rdquo;結(jié)構(gòu)和功能異常的腫瘤血管，使之更有效地傳遞氧和釋放化療藥物。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了部分化療藥物通過(guò)節(jié)奏性給藥的方式也能誘導(dǎo)“腫瘤血管正?；翱?rdquo;。在我們的實(shí)驗(yàn)中紫杉醇治療后第2d MVD減少，第14d減少更為明顯，故我們推測(cè)紫杉醇脂質(zhì)體給藥后能部分刪減異常的腫瘤血管，改善腫瘤組織血供，導(dǎo)致局部乏氧減少，后由于血管的廣泛損傷，腫瘤組織血流減少，從而增加腫瘤組織乏氧。

    紫杉醇能直接殺死癌細(xì)胞，又能影響腫瘤局部的乏氧，因此可以設(shè)想在紫杉醇治療初期，腫瘤乏氧降低，放化療更容易到達(dá)腫瘤局部進(jìn)而增加其療效，此期宜聯(lián)合放化療措施；在紫杉醇治療后期，腫瘤乏氧增加，此期聯(lián)合應(yīng)用紫杉醇和乏氧特異性細(xì)胞毒物質(zhì)的治療方案，也許是控制腫瘤的較佳選擇[1]。

 

【參考文獻(xiàn)】
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[7] Jain RK. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy[J]. Science, 2005,307(5706):58-62.

作者：鄭勇斌，童仕倫， 赫 杰，馬書進(jìn)

作者單位：武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060