軟骨復(fù)合物對小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防作用

【摘要】  目的 觀察口服軟骨復(fù)合物對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的預(yù)防作用。方法 口服軟骨復(fù)合物兩周后，再注射弗氏完全佐劑(Freund′s complete adjuvant，F(xiàn)CA)誘發(fā)小鼠RA模型，通過觀察小鼠關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)的變化，測定小鼠各器官的指數(shù)，檢測小鼠血清中一氧化氮(nitric oxide，NO)和腫瘤壞死因子α(TNFα)水平以及關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的變化來評價(jià)口服軟骨復(fù)合物對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防作用。結(jié)果 軟骨復(fù)合物能較有效的改善關(guān)節(jié)的腫脹度，并顯著地提高小鼠的胸腺指數(shù)(P<0.01)，顯著地提高脾指數(shù)(P<0.05)，明顯降低NO和TNFα水平；組織病理學(xué)顯示給藥組關(guān)節(jié)的變形破壞得到減輕。結(jié)論 軟骨復(fù)合物能有效地起到預(yù)防佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用，然而其治療作用還有待進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】  軟骨復(fù)合物 關(guān)節(jié)炎 風(fēng)濕性 一氧化氮 腫瘤壞死因子α

    Preventive Effect of Cartilage Compound on Rheumatoid

    Arthritis in Mice

    LIU Yingfen，ZHANG Guorong，CHEN Hongshuo，LIU Anjun

    (Department of Food Engineering & Biotechnology，Tianjin University of Science

    & Technology，Tianjin 300457，China) 

    【Abstract】  ob[x]jective  To investigate the preventive effect of cartilage compound on rheumatoid arthritis (RA) in mice. Method  The animal model was set up by injection of Freund′s complete adjuvant (FCA). After oral administration of cartilage compound for 2 weeks，the changes of mean arthritic index were observed，indexes of organs were tested，changes of nitric oxide (NO) concentrations was assessed，tumor necrosis factor α (TNFα) in blood serum was examined，and histological examination was carried out to evaluate the preventive effect on RA. Results  The cartilage compound alleviated the swelling of the joints. The index of thymus was increased significantly (P<0.01). The index of spleen was also increased (P<0.05). Oral administration of cartilage compound decreased the concentrations of NO and TNFα，and suppressed the histopathological changes in RA mice. Conclusion  The cartilage compound shows obvious preventive effect on rheumatoid arthritis in mice，induced by Freund′s complete adjuvant. However，its therapeutic action need to be studied further.

    【Key words】  Cartilage compound;  Ahritis，rheumatoid;  NO;  TNFα

    牛鼻軟骨的主要成分為Ⅱ型膠原蛋白和軟骨多糖。據(jù)國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道，口服牛源和雞源Ⅱ型膠原蛋白均能使機(jī)體產(chǎn)生口服耐受，從而預(yù)防佐劑性關(guān)節(jié)炎［1］；膠原多肽對關(guān)節(jié)炎等膠原病具有很好的預(yù)防及治療作用［2］；硫酸軟骨素已在臨床上用于治療風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)炎、腎炎、腰痛、神經(jīng)痛及頭痛且取得較好療效，并發(fā)現(xiàn)口服幾乎無，但對于軟骨復(fù)合物的研究較少［3］。

    在日本，膠原食品已被作為健康食品推向市場，已經(jīng)有膠原多肽等保健性食品上市［4］。在美國，氨基葡聚糖和硫酸軟骨素的合成制劑已添加至食品中，具有非常高的安全信度［5］，但我國在此方面還是空白。本研究以牛鼻軟骨為原料，經(jīng)過處理得到膠原多肽和軟骨多糖的復(fù)合物，并以弗氏完全佐劑建立小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型來研究其預(yù)防作用，為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防提供新的物質(zhì)。

    1  材料和方法

    1.1  軟骨復(fù)合物制備

    取牛鼻軟骨洗凈，6 mol/L鹽酸脫鈣24 h，洗凈，-20℃冷凍，用切片機(jī)切細(xì)后，膠體研磨成粉，軟骨粉與堿性蛋白酶以2：1 000比例于52℃水浴中加熱水解10 h，其間不斷攪拌并一直保持pH 8.5，得到消化液后離心取上清液，冷凍干燥即得到實(shí)驗(yàn)用的軟骨復(fù)合物干粉。

    1.2  實(shí)驗(yàn)動物

    昆明種小鼠，雄性，體重(20g±1)g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動物中心提供，許可證號SCXK(軍)2002001。

    1.3  試劑

    弗氏完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；一氧化氮(NO)含量檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α(TNFα)試劑盒購于上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.4  儀器

    酶標(biāo)儀，Thermo Electron，美國；LXJ6401離心機(jī)，河北省吳橋電機(jī)廠。

    1.5  實(shí)驗(yàn)分組及模型建立

    30只昆明種清潔級小鼠，普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為3組。軟骨復(fù)合物溶于蒸餾水，按照每天1 500 mg/kg計(jì)算給藥量［6］。每天灌胃1次，空白組和模型組均予相同體積的蒸餾水灌胃，給藥組灌胃兩周后，應(yīng)用弗氏完全佐劑建立關(guān)節(jié)炎模型。于模型組和給藥組小鼠右后足趾一次性注射0.1 mL的弗氏完全佐劑建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，對照組注射0.1 mL的生理鹽水。

    1.6  小鼠關(guān)節(jié)病變的發(fā)生和嚴(yán)重程度觀察

    建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型后開始觀察關(guān)節(jié)的原發(fā)性急性(7 d之內(nèi))病變情況，每天觀察1次。用卡尺測量小鼠足跖厚度和關(guān)節(jié)的寬度，與正常小鼠比較，增加0.1～0.2 mm為輕度腫脹，增加0.3～0.4 mm為中度腫脹，增加超過0.5 mm為重度腫脹。以小鼠至少有一只腳爪在連續(xù)兩次觀察中出現(xiàn)紅腫，作為關(guān)節(jié)炎發(fā)生的標(biāo)準(zhǔn)［7］。并且按以下標(biāo)準(zhǔn)對四肢關(guān)節(jié)病變程度進(jìn)行評分：0分為正常，1分為輕度紅腫，2分為中度紅腫，3分為嚴(yán)重腫脹，4分為關(guān)節(jié)變形、強(qiáng)直［8］。每只動物的關(guān)節(jié)炎評價(jià)分?jǐn)?shù)為四肢關(guān)節(jié)評價(jià)分?jǐn)?shù)之和。該組所有小鼠關(guān)節(jié)炎評價(jià)分?jǐn)?shù)的總和除以該組小鼠的只數(shù)，即為該組平均關(guān)節(jié)炎評價(jià)分?jǐn)?shù)(mean arthritic index，MAI)。

    1.7  小鼠器官指數(shù)的測定

    建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型12 d后，將小鼠解剖，取出胸腺、脾臟并稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)和肝指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺重(mg)/體重(g)；脾指數(shù)=脾重(mg)/體重(g)。

    1.8  小鼠相關(guān)血清指標(biāo)的測定

    建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型12 d后，將小鼠摘除眼球采血，然后用血清測定NO和TNFα含量。NO含量用硝酸還原法測定，TNFα采用雙抗體夾心ABCELISA法測定。

    1.9  小鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察

    建立模型12 d后，取小鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)窩于4%多聚甲醛中固定12 h，EDTA脫鈣，脫水，石蠟包埋，組織切片(厚度5 μm)進(jìn)行HE染色。

    1.10  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)用±s表示，采用組間t檢驗(yàn)。

    2  結(jié)果

    2.1  軟骨復(fù)合物對小鼠關(guān)節(jié)炎評價(jià)分?jǐn)?shù)的影響

    如表1所示為軟骨復(fù)合物對小鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分的影響，表中所示1 d為注射前的評分，注射佐劑后，模型組和給藥組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的炎癥反應(yīng)，均在第3天達(dá)到高峰，小鼠出現(xiàn)右后足紅腫、熱，嚴(yán)重者不能負(fù)重的急性炎癥表現(xiàn)，而模型組一直極顯著高于對照組(P<0.01)。從第4天開始3組小鼠的炎癥均逐漸消退。在注射佐劑后第3 d和4 d，給藥組與模型組差異不顯著，但隨著時(shí)間的延長，給藥組在第5天和第6天時(shí)的效果與模型組相比差異具有顯著性(P<0.05)；說明灌胃軟骨復(fù)合物能較有效的改善急性炎癥期小鼠關(guān)節(jié)的腫脹度。表1  軟骨復(fù)合物灌胃對關(guān)節(jié)炎評價(jià)分?jǐn)?shù)的影響注：* P<0.05與對照組相比；** P<0.01與對照組相比；△ P<0.05，△△ P<0.01與模型組相比。

    Note：* P<0.05 vs. control group；** P<0.01 vs. control group; △ P<0.05，△△ P<0.01 vs. model group.

    2.2  軟骨復(fù)合物對小鼠器官指數(shù)的影響

    表2為小鼠各器官指數(shù)，從表中可以看出，給藥組小鼠的胸腺指數(shù)極明顯高于模型組和對照組（P<0.01），且組內(nèi)差異不顯著；給藥組的脾指數(shù)比模型組高但并無顯著的差異，但明顯地高于對照組(P<0.05)。表2  各組小鼠器官指注：*P<0.05與對照組相比；**P<0.01與對照組相比；△P<0.05，△△P<0.01與模型組相比。

    Note：* P<0.05 vs. control group；** P<0.01 vs. control group; △ P<0.05，△△ P<0.01 vs. model group.

    2.3  軟骨復(fù)合物對小鼠血清中NO和TNFα含量的影響

    從表3中可見，給藥組的小鼠血清中的NO含量明顯低于模型組(P<0.05)，但與對照組并無差異；模型組小鼠血清中的NO含量明顯高于對照組(P<0.05)。給藥組的小鼠血清中的TNFα含量極明顯低于模型組(P<0.01)并且與對照組并無明顯差別；模型組小鼠血清中TNFα含量明顯高于對照組(P<0.05)。表3  小鼠血清中NO和TNFα含量測定結(jié)果注：* P<0.05，** P<0.01與對照組相比；△ P<0.05，△△ P<0.01與模型組相比。

    2.4  軟骨復(fù)合物對小鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化的影響

    圖1所示為關(guān)節(jié)窩的HE染色，圖中可以看出對照組關(guān)節(jié)軟骨層較厚，表面平滑，未見關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)破壞，而與對照組相比，模型組和給藥組的軟骨層都有結(jié)構(gòu)上的改變，均呈現(xiàn)出關(guān)節(jié)軟骨厚薄不均，軟骨層表面粗糙，但相比模型組，給藥組的病理改變有所減輕（圖1見彩插）。

    3  討論

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)為自身免疫性疾病。完全弗氏佐劑(FCA)誘導(dǎo)產(chǎn)生佐劑性關(guān)節(jié)炎，因其臨床表現(xiàn)、病理組織學(xué)及免疫學(xué)特征都與人類的RA極為相似，因而被認(rèn)為是研究人類RA的理想模型。據(jù)報(bào)道，口服膠原蛋白可誘導(dǎo)外周免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原特異性無反應(yīng)狀態(tài)，引起機(jī)體對該抗原產(chǎn)生全身性低免疫應(yīng)答狀態(tài)，其主要通過腸黏膜淋巴組織激活T細(xì)胞，釋放出抑制性細(xì)胞因子，降低自身免疫性疾病患者病灶處的炎癥細(xì)胞數(shù)，從而抑制炎癥反應(yīng)。牛軟骨中含有豐富的Ⅱ型膠原蛋白和軟骨多糖。為了證實(shí)膠原多肽和軟骨多糖共同作用能提高機(jī)體免疫力，起到預(yù)防關(guān)節(jié)炎的作用，我們對小鼠進(jìn)行灌胃給藥，探討軟骨復(fù)合物可能的預(yù)防作用。

    在本實(shí)驗(yàn)中觀察到小鼠在注射完全弗氏佐劑的次日會出現(xiàn)右后足紅腫且熱，關(guān)節(jié)處也能觀察到有明顯的腫脹，嚴(yán)重者不能負(fù)重等急性炎癥表現(xiàn)，約持續(xù)3 d，該肢體炎癥逐漸消退，這與佐劑性關(guān)節(jié)炎的特征相符［9］，說明通過小鼠足趾部皮下注射完全弗氏佐劑，可以形成小鼠關(guān)節(jié)炎炎癥模型，而從結(jié)果中可以看出，給藥組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)能較明顯低于模型組，即通過給藥能較好的緩解此急性炎癥，起到預(yù)防關(guān)節(jié)炎的作用。小鼠器官的指數(shù)也可以看出，該復(fù)合物能提高免疫器官的指數(shù)，有利小鼠的生長，提高小鼠的免疫力。NO作為一種高反應(yīng)性細(xì)胞毒的自由基，與機(jī)體特異性免疫反應(yīng)、自身免疫病密切相關(guān)，其在許多疾病中對組織造成損傷已得到了證實(shí)，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過口服軟骨復(fù)合物能有效地降低小鼠體內(nèi)NO的含量，緩解了小鼠體內(nèi)的炎癥。TNFα是RA關(guān)節(jié)損傷的病理過程中單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子，是關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要炎性介質(zhì)和RA發(fā)病機(jī)制中居中心地位的促炎癥細(xì)胞因子，參與機(jī)體免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，在關(guān)節(jié)炎免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用［10］。他的作用與含量有關(guān)，正常水平對機(jī)體有利，產(chǎn)生過多會引起一系列炎性損害，并被認(rèn)為是關(guān)節(jié)炎病程中調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵細(xì)胞因子［11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明給藥組的TNF α含量顯著性降低，說明軟骨復(fù)合物能通過調(diào)控細(xì)胞因子的分泌而參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。另外，從關(guān)節(jié)的HE染色可以看出軟骨復(fù)合物有效減輕小鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)窩的軟骨層的病理改變，從而預(yù)防了關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生。

    綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明軟骨復(fù)合物對小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎有顯著的預(yù)防作用，其機(jī)理可能是通過提高機(jī)體免疫力，抑制炎性細(xì)胞因子的分泌，從而抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，是預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的新物質(zhì)，而其對關(guān)節(jié)炎的治療作用有待進(jìn)一步研究。

 

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作者：劉穎芬

作者單位：天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457