海洋新放線菌及其次級代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展

作者：王淑霞 朱天驕 盧圳域 顧謙群* 朱偉明*

作者單位：教育部海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院， 青島266003

【摘要】  由于自身特殊的生存環(huán)境，海洋放線菌具有復(fù)雜獨(dú)特的代謝途徑，產(chǎn)生了諸多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級代謝產(chǎn)物，這些活性代謝產(chǎn)物為新抗生素的發(fā)現(xiàn)提供了豐富的先導(dǎo)化合物，有些已經(jīng)進(jìn)入臨床前研究。本文簡要介紹近十幾年從海洋樣品中分離到的放線菌新種屬及其次級代謝產(chǎn)物研究概況。

【關(guān)鍵詞】  海洋放線菌； 代謝產(chǎn)物； Salinispora； Verrucosispora； Marinispora

    Recent progress in the discovery of new marine-derived actinomycetes

    and their secondary me[x]tabolites

    Wang Shu-xia,  Zhu Tian-jiao,   Lu Zhen-yu,  Gu Qian-qun  and  Zhu Wei-ming

    (Key Laboratory of Marine Drugs of Ministry of Education, China, Key Laboratory of Marine Drugs of Shandong Province,

    School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China,  Qingdao 266003)

    ABSTRACT  Due to the special living environment, marine-derived actinomycetes possess distinct and complex me[x]tabolic capabilities, resulting in wide diversity of their secondary me[x]tabolites in chemical structure and biological activity. Among them, many valuable leading compounds were obtained for discovery of new antibiotics, and some had been selected for preclinical study. The research advances in discovery of new actinomycetes and their secondary me[x]tabolites were briefly reviewed in this paper.

    KEY WORDS  Marine-derived actinomycetes;me[x]tabolites;Salinispora;Verrucosispora;Marinispora

    放線菌是一類高(G+C)%的革蘭陽性細(xì)菌，與人類關(guān)系密切。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的天然抗生素中70%來自于放線菌家族［1］，如鏈霉素、阿奇霉素、萬古霉素等，在臨床上都有非常廣泛的應(yīng)用，為人類健康做出了巨大的貢獻(xiàn)。

    隨著抗生素的廣泛使用，致病菌耐藥性急劇增加，原有的抗生素療效已經(jīng)大幅度降低，新的疾病不斷出現(xiàn)，這些都給抗生素發(fā)展帶來了巨大的挑戰(zhàn)，發(fā)現(xiàn)新菌種以尋找新型抗生素成為迫切的需要。但經(jīng)過50年多年的探索從陸生放線菌中發(fā)現(xiàn)新菌種、新抗生素的機(jī)率大大降低［2］，于是人們把眼光投向曾經(jīng)一直被忽略的一個(gè)巨大的資源寶庫——海洋［3］。

    海洋環(huán)境具有高鹽度、高壓、低溫、低營養(yǎng)等特點(diǎn)，在這種特殊環(huán)境中生存的海洋放線菌，必然發(fā)展出不同于陸生放線菌的獨(dú)特的代謝途徑，這為新菌種、新的活性化合物的發(fā)現(xiàn)提供了條件。近十幾年對海洋放線菌的研究結(jié)果也充分證明了這一點(diǎn)?，F(xiàn)已從海洋放線菌中分到了很多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性廣泛的新化合物［4］，為新抗生素的發(fā)現(xiàn)提供了寶貴的先導(dǎo)化合物資源，有的化合物已經(jīng)進(jìn)入臨床前研究階段，如salinosporamide A。本文對近十幾年發(fā)現(xiàn)的海洋放線菌新種屬及其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行簡要綜述。

    1  海洋放線菌新種屬

    近十幾年研究發(fā)現(xiàn)海洋放線菌在種類上與陸生放線菌不同，陸生放線菌主要以鏈霉菌為主；海洋放線菌隨著樣品采集深度的增加，鏈霉菌逐漸減少，而含有分枝菌酸的放線菌(mycolata)增多［5］，發(fā)現(xiàn)的新種屬也主要是這一類(表1)。

    2  次級代謝產(chǎn)物研究

    2.1  Salinispora屬

    1991年Fenical小組從海泥樣品中分離得到一類依賴海水生長的特殊放線菌MAR1，這也是發(fā)現(xiàn)的需鹽生長的放線菌［6］，對其16S rRNA序列分析表明它們是小單孢菌科的一個(gè)新屬［3］，首先命名為Salinospora，后更名為Salinispora。Salinispora屬放線菌，廣泛存在于熱帶、亞熱帶的海泥中，此外也存在于其它生物體內(nèi)，如2005年，Tae等從采自大堡礁的一株海綿Pseudoceratina clavata中也分到了這個(gè)屬的菌株［7］?，F(xiàn)已分離到Salinispora屬放線菌2500多株，目前已經(jīng)確定了三個(gè)種Salinispora tropica、Salinispora arenicola［8］和Salinispora pacifica［9］。這個(gè)屬的菌株發(fā)酵粗提物具有廣泛的生物活性［3］，對本屬菌株的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了化學(xué)和生物學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了一系列結(jié)構(gòu)新穎的高活性化合物。

    2003～2005年，F(xiàn)enical小組從菌株Salinispora tropica CNB-392中分離得到8個(gè)γ-內(nèi)酰胺類化合物1～8［10，11］，其中salinosporamide A(1)對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.035nmol/L。對NCI 60種癌細(xì)胞系的半數(shù)生長抑制濃度(GI50)小于11nmol/L，進(jìn)一步的活性評價(jià)發(fā)現(xiàn)，化合物1對非小細(xì)胞肺癌(NCI-H226)、中樞神經(jīng)癌(SNB-75)、黑色素瘤(SK-MEL-28)及乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-435)具有強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，其半數(shù)致死濃度(LC50)均低于11nmol/L，但是對非白血性白血病(CCRF-CEM)、前列腺癌(DU-145)作用微弱(表2)，這表明1具有良好的選擇性細(xì)胞毒活性，這種獨(dú)特的選擇性，對于成藥來說是非常有利的。由于1與蛋白酶體抑制劑omuralide(9)具有相同的母核結(jié)構(gòu)，故對1進(jìn)行了蛋白酶體抑制活性的測試。測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)1是強(qiáng)效蛋白酶體抑制劑，對糜凝乳蛋白酶體的IC50達(dá)到1.3nmol/L，抑制活性約為9的35倍。蛋白酶體參與人體許多調(diào)控蛋白質(zhì)更新和加工過程，因而蛋白酶體抑制劑具有廣泛的藥理作用，如抗癌、逆轉(zhuǎn)耐藥、治療炎性細(xì)胞因子活化誘發(fā)的疾病等［12］。這些都預(yù)示著1具有非常廣闊成藥前景。目前1已經(jīng)作為癌癥治療藥物進(jìn)入臨床前研究［13，14］。

    對該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，又發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的鹵代大環(huán)內(nèi)酯類化合物sporolides A(10)和sporolides B(11)［15］，11對人結(jié)腸癌細(xì)胞抑制濃度大于78μg/ml，對耐甲氧西林的金葡菌(Staphylococcus aureus)抑制濃度超過250μg/ml。雖然9和10活性較差，但其新穎獨(dú)特的結(jié)構(gòu)讓人們看到海洋放線菌產(chǎn)生新型次級代謝產(chǎn)物的巨大潛力。

    2005年，F(xiàn)enical小組又對這個(gè)屬的另一株放線菌Salinispora pacifica CNS103的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的化合物cyanosporasides A(12)和cyanosporasides B(13)［9］。對其活性評價(jià)目前正在進(jìn)行中。12和13是海洋放線菌次級代謝產(chǎn)物化學(xué)多樣性的又一例證。

    2006年，F(xiàn)enical小組從菌株Salinispora arenicola CNR005的發(fā)酵液中得到兩個(gè)新穎的聚酮類化合物saliniketal A(14)和saliniketal B(15)［16］。14和15沒 表1        海洋放線菌新種屬表2  Salinosporamide A對NCI部分癌細(xì)胞系的LC50有鳥氨酸脫羧酶抑制活性，但是與一種強(qiáng)效鳥氨酸脫羧酶激動劑TPA聯(lián)合使用時(shí)，可抑制其激動作用，IC50分別為(1.95±0.37)和(7.83±0.12)μg/ml。鳥氨酸脫羧酶是多胺生物合成途徑的限速酶，激動此酶會促進(jìn)細(xì)胞增殖，被認(rèn)為與癌癥發(fā)病有關(guān)，而鳥氨酸脫羧酶抑制劑則有可能成為有效的防治癌癥的藥物。因此14和15具有成為先導(dǎo)化合物或候選藥物的潛力。

    2.2  Verrucosispora屬

    Verrucosispora屬早是在1998年Rheims等從沼澤淤泥中分離得到［17］。2004年Bister等從日本海289米深的海底泥樣中分離得到菌株AB-18-032，化學(xué)分類學(xué)及16S rRNA序列分析表明是一個(gè)本屬新種Verrucosispora sp.。對其次級代謝產(chǎn)物研究得到了一類多環(huán)聚酮類抗生素abyssomicin B～D(16～18)［18］，其中abyssomicin C(17)可強(qiáng)烈抑制革蘭陽性菌的生長，甚至可以抑制耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的生長。對MRSA N315的MIC為4μg/ml，對耐萬古霉素(vancomycin)的MRSA Mu50的MIC為13μg/ml。對其抑菌作用機(jī)制的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，此化合物是通過作用于葉酸代謝過程而抑制細(xì)菌的生長，但其作用機(jī)制與磺胺類藥物不同，磺胺類藥物是通過競爭性拮抗PADA(對氨基苯甲酸)，干擾細(xì)菌酶系統(tǒng)對PADA的利用，從而影響葉酸輔酶的生成。Abyssomicin C是通過抑制細(xì)菌體內(nèi)PADA的合成從而抑制葉酸輔酶的生物合成［19］。這是一種新的抑菌作用靶點(diǎn)，對尋找新型高效抗生素具有積極作用， 為抗生素的發(fā)展提供了新的方向。

    2.3  Marinispora屬

    發(fā)現(xiàn)Salinispora屬之后，F(xiàn)enical小組又展開了一系列調(diào)查，以尋找新的海洋放線菌，Marinispora屬(MAR2)就是在這個(gè)過程中發(fā)現(xiàn)的。Marinispora屬也是專屬海洋性的放線菌，是鏈霉菌科的一個(gè)新屬［20］，目前已從不同的采集地點(diǎn)的海泥樣品中分離得到了20株本屬菌株，表明Marinispora屬在海洋環(huán)境中也是廣泛存在的。對本屬菌株CNQ-140次級代謝產(chǎn)物采用活性追蹤的方法分離得到了一系列高活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物marinomycins A～D(19～22)［21］?；钚詼y試結(jié)果表明19～22具有強(qiáng)的抗菌和細(xì)胞毒活性。其中活性顯著的是marinomycins A(19)，它對MRSA和耐萬古霉素的糞鏈球菌(VRSF)的MIC90均達(dá)到

    .13μmol/L。在NCI 60株癌細(xì)胞系的活性測試中發(fā)現(xiàn)此類化合物具有特異的組織選擇性細(xì)胞毒活性，19對八種黑色素瘤細(xì)胞系中的六種(LOX IMVI、M14、SK-MEL-2、SK-MEL-5、UACC-257、UACC-62)具有強(qiáng)烈的抑制作用，尤其是對SK-MEL-5，其LC50達(dá)到5.0nmol/L。20和21的平均LC50達(dá)到0.9和0.2μmol/L。更值得矚目的是這些化合物對非白血性白血病癌細(xì)胞只有非常微弱的抑制作用，LC50約為50μmol/L。這不僅表明了此類化合物具有組織選擇性，更預(yù)示此類化合物如果成藥，其骨髓抑制的不良反應(yīng)有可能很小。

    2.4  MAR4

    MAR4也是Fenical小組在發(fā)現(xiàn)Salinispora屬之后發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)鏈霉菌新種［22］，對這個(gè)種部分菌株的次級代謝產(chǎn)物研究表明，本種是一類罕見的、產(chǎn)混源萜類(meroterpenoids)化合物的放線菌［23］。1992年從菌株CNB-632中分離得到marinone(23)和debromomarinone(24)［24］。2000年，從菌株CNH-099中分離得到neomarinone(25)和一系列marinone的衍生物isomarinone(26)、hydroxydebromomarinone(27)和methoxydebromomarinone(28)。對25～28進(jìn)行了抗腫瘤活性測試發(fā)現(xiàn)這些化合物具有中等抗腫瘤活性，對腫瘤細(xì)胞HCT-116的平均IC50約為8μg/ml［25］。28對NCI 60種癌細(xì)胞系的平均IC50達(dá)到10μmol/L。2005年從菌株CNQ-525中分離得到5個(gè)萜類化合物29～33，對29～32進(jìn)行了抗菌和抗腫瘤活性測試，結(jié)果見表3［26］，這些化合物對耐藥菌具有強(qiáng)的抑制作用和細(xì)胞毒活性。其中30的抑菌活性較差，但抗腫瘤活性較好，其構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。2006年，從菌株CNQ766中分離得到兩個(gè)聚酮類化合物actinofuranones A(34)、actinofuranones B(35)和一個(gè)新的混源萜類化合物azamerone(36)［23，27］， 其抗腫瘤活性正在表3    化合物26～29的抗菌及抗腫瘤活性測試中。

    綜上所述，海洋放線菌與陸生放線菌的次級代謝產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)、活性方面存在著很大的差異。與陸生放線菌相比，海洋放線菌的次級代謝產(chǎn)物分子中多含有鹵族元素、多為內(nèi)酯和內(nèi)酰胺以及萜類化合物；其次級代謝產(chǎn)物具有新的抗菌作用靶點(diǎn)、對腫瘤細(xì)胞和耐藥性致病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。

    3  結(jié)語

    總之，近十幾年的研究結(jié)果表明，海洋環(huán)境中存在著一個(gè)巨大的海洋放線菌資源寶庫。生活在海洋這一特殊環(huán)境中的放線菌，其生理生化和16s rRNA等分子生物學(xué)特征與陸生放線菌有很大的區(qū)別，其次級代謝途徑亦不同于陸生放線菌，從而產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)類型新穎多樣、生物活性顯著的次級代謝產(chǎn)物，為新型抗生素的發(fā)現(xiàn)提供了重要的先導(dǎo)化合物和新的藥物作用靶點(diǎn)。隨著研究的深入，海洋放線菌將成為發(fā)現(xiàn)新抗生素的重要資源。

 

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