研究小組用高通量測(cè)序技術(shù)確定RNA結(jié)構(gòu)

 利用深度測(cè)序進(jìn)行全基因組RNA結(jié)構(gòu)檢測(cè) 通過(guò)圖示概述了Kertesz(左)和Underwood(右)所用的方法。注意在Underwood的研究中，孵育對(duì)照(有或無(wú)激酶處理組)是平行完成的。

　　模平行測(cè)序技術(shù)使得研究人員能夠?qū)蚪M進(jìn)行快速的深度測(cè)序，從而從根本上改變了基因組學(xué)的發(fā)展。在本期的《自然-方法學(xué)》(Nature Methods)和《自然》(Nature)雜志兩篇新的論文中Underwood和Kertesz兩個(gè)研究小組利用高通量測(cè)序技術(shù)確定了所有RNA轉(zhuǎn)錄物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

　　在過(guò)去的一些研究中全基因組測(cè)序技術(shù)被應(yīng)用于確定細(xì)胞結(jié)構(gòu)與DNA區(qū)域或mRNAs之間形成的復(fù)合物的特征。雖然這些研究提供了關(guān)于調(diào)控復(fù)合物組成的信息，然而研究人員卻無(wú)法解析這些RNAs的結(jié)構(gòu)

　　近的研究證實(shí)RNAs在調(diào)控基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮了多重功能，這一課題日益引起了研究界的廣泛關(guān)注。在這些調(diào)控過(guò)程中，RNA的結(jié)構(gòu)是一個(gè)關(guān)鍵的影響因素——決定了是直接監(jiān)控外部或內(nèi)部信號(hào)，或是為反式作用因子提供特異的結(jié)合位點(diǎn)。

　　RNA轉(zhuǎn)錄物是一種單鏈分子，當(dāng)其發(fā)生自身折疊并形成Watson-Crick堿基對(duì)，可生成各種長(zhǎng)度和不同復(fù)雜性的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)是RNA中普通的二級(jí)結(jié)構(gòu)形式，其進(jìn)一步組裝則形成了復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。了解RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是研究人員揭示RNA活性，發(fā)現(xiàn)伴侶蛋白結(jié)合印跡及突變影響關(guān)鍵性的步。

　　對(duì)于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的RNAs，檢測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)高效和安全的方法就是對(duì)同源序列進(jìn)行種系發(fā)生比較。科學(xué)家們認(rèn)為同源序列可生成相似的折疊，從而維持了相同的核心螺旋數(shù)目和長(zhǎng)度。在保守的Watson-Crick堿基對(duì)區(qū)域，Watson-Crick堿基對(duì)改變通常是兩個(gè)核苷酸遵循Watson-Crick堿基配對(duì)而同時(shí)發(fā)生變化。然而在種系發(fā)生過(guò)程中由于序列具有高度保守性此時(shí)該機(jī)制不發(fā)生作用，從而不顯示核苷酸協(xié)同變異。

　　當(dāng)RNA具有超過(guò)一個(gè)穩(wěn)定折疊的結(jié)構(gòu)時(shí)，種系發(fā)生比較是非常困難的。在這種情況下，研究人員只能借助電腦模擬的方法，基于實(shí)驗(yàn)獲得堿基對(duì)能量集合通過(guò)大化堿基對(duì)數(shù)目計(jì)算出小的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能。

　　在試驗(yàn)中研究人員可通過(guò)化學(xué)檢測(cè)或酶檢測(cè)的方法解決這些問(wèn)題。這些試驗(yàn)可在缺乏或存在蛋白質(zhì)或其他配體以及各種溫度或條件下在體外或體內(nèi)完成。無(wú)論是化學(xué)檢測(cè)還是酶檢測(cè)，RNA的可接近性都是反應(yīng)的重要標(biāo)準(zhǔn)。在化學(xué)檢測(cè)中，一個(gè)成分確定的化合物可通過(guò)與RNA堿基上某個(gè)精密位點(diǎn)或糖磷骨架發(fā)生反應(yīng)，從而對(duì)RNA起作用。

　　在酶檢測(cè)中，則是用一種RNA切割酶與RNA的非配對(duì)或配對(duì)區(qū)域發(fā)生反應(yīng)。通過(guò)這種檢測(cè)方法(通常在引物延伸后用凝膠電泳方法檢測(cè)片段)顯示出在結(jié)構(gòu)上與化合物或酶易于接近的堿基?；衔餀z測(cè)生成的是原子水平的信息，而酶檢測(cè)主要生成螺旋和非螺旋區(qū)域的信息。這些實(shí)驗(yàn)方法通常工作量大，在各種操作過(guò)程中需要多種專業(yè)知識(shí)。這樣的數(shù)據(jù)可局限性地應(yīng)用于計(jì)算機(jī)折疊程序中，利用序列預(yù)測(cè)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

　　Underwood和Kertesz利用了高通量深度測(cè)序策略獲得了從細(xì)胞中抽提的RNA轉(zhuǎn)錄物復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息(圖1)。在兩篇論文中，研究人員分別獲得了來(lái)自酵母或小鼠細(xì)胞的RNAs，在確定的實(shí)驗(yàn)條件下按照選擇的尺寸對(duì)其進(jìn)行酶水解。酶水解的RNA產(chǎn)生了5′-磷酸基，利用接頭選擇性連接切割的片段而非帶有5′-OH片段的水解降解產(chǎn)物。在反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增后，對(duì)生成的文庫(kù)進(jìn)行深度測(cè)序。

　　這兩篇論文使用的方法不同之處在于所使用的酶以及數(shù)據(jù)處理的方式。Kertesz等利用了兩種酶：RNase V1，可特異識(shí)別RNA雙鏈區(qū)域;S1單鏈核酸酶(nuclease S1),可特異性識(shí)別RNA單鏈區(qū)域。后的得分是RNase V1和nuclease S1從分析殘基后的核苷酸開始切割形成的片段讀數(shù)的log值。Underwood等利用了一個(gè)特異識(shí)別RNA單鏈區(qū)域的P1單鏈核酸酶(nuclease P1)，并設(shè)立了兩個(gè)對(duì)照，其中一個(gè)未經(jīng)核酸酶處理以估計(jì)內(nèi)源切割保留的5′磷酸鹽的量，另一個(gè)則加入了T4連接酶檢測(cè)未保留5′磷酸鹽的切割。后得分是核酸酶組與對(duì)照組計(jì)數(shù)值的log值。

　　酶檢測(cè)的一個(gè)重要條件是每個(gè)RNA分子僅能切割一次，因?yàn)槎吻懈顚o(wú)法反映其天然狀態(tài)。所有類型的RNA分子切割條件很少相同，并且不能確定單擊動(dòng)力學(xué)是否完成。Kertesz等，過(guò)假定堿處理導(dǎo)致了5′-OH片段，且這種5′-OH片段可避開深度測(cè)序分析而對(duì)非特異性切割進(jìn)行間接控制。Underwood等在分析中就間接考慮了控制，因此數(shù)據(jù)在更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)上(圖1)。

　　Underwood等采用的方法具有的明顯優(yōu)勢(shì)，作者提供了一個(gè)軟件可將圖形序列讀值轉(zhuǎn)化為一種可被加州大學(xué)圣克魯斯分校(UCSC)基因組瀏覽程序識(shí)別的格式序列，也可通過(guò)輸入到一種RNA預(yù)測(cè)軟件中得到與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和能量小化計(jì)算結(jié)果相容的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果。

　　將S1或P1單鏈核苷酸與RNase V1結(jié)合使用提供了互補(bǔ)的信息，并對(duì)RNA結(jié)構(gòu)分析添加了限制。這些酶探針通常對(duì)空間位阻敏感，因此不會(huì)生成RNA結(jié)構(gòu)的原子信息。在未來(lái)研究人員有可能利用化學(xué)探針提供更詳細(xì)的信息，并使其在體內(nèi)容易使用

　　雖然這兩種方法都有著相同的缺點(diǎn)即由于需從細(xì)胞中抽提RNAs并在緩沖液中復(fù)性從而有可能生成體外結(jié)果，然而它們打開了多個(gè)研究方向。其衍生的一個(gè)生物體基因組上的RNA結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)完整圖像對(duì)應(yīng)著廣泛的環(huán)境條件例如溫度、pH值或其他。利用平行測(cè)序，并通過(guò)在原核或真核細(xì)胞中添加各種調(diào)控因子(RNA結(jié)合蛋白、代謝產(chǎn)物或調(diào)控反式作用RNA)的方法可對(duì)全RNA的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行監(jiān)控。這一實(shí)驗(yàn)還將有助于鑒別靶向調(diào)控因子的整套原始RNA?，F(xiàn)在在活細(xì)菌中或在真核細(xì)胞無(wú)生命或有生命壓力下對(duì)對(duì)應(yīng)環(huán)境變化的RNA結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行完全檢測(cè)已經(jīng)成為了可以達(dá)成的目標(biāo)。而那樣的一種“RNA結(jié)構(gòu)組”將是在活生物體內(nèi)建立以RNA為基礎(chǔ)的調(diào)控和反應(yīng)性網(wǎng)絡(luò)所必需的。

　　12月份出版的《自然—方法學(xué)》刊登了一篇文章，描述了一種高通量RNA結(jié)構(gòu)測(cè)定方法——“片段化測(cè)序”法(Fragmentation sequencing ，F(xiàn)ragSeq)。相關(guān)研究由美國(guó)加州大學(xué)圣克魯茲分?；羧A德·休斯醫(yī)學(xué)研究院教授索菲·薩拉馬(Sofie Salama)所領(lǐng)導(dǎo)的課題組完成。

　　RNA對(duì)基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性的調(diào)控作用成為近來(lái)研究的熱點(diǎn)，而弄清RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是理解RNA功能的個(gè)必要步驟。測(cè)定非編碼RNA結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法是化學(xué)法和酶法，但是它們一次只能測(cè)定一個(gè)RNA分子，這種方法不僅費(fèi)力而且對(duì)技術(shù)要求高。FragSeq法卻可以在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平同時(shí)對(duì)大量RNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定。

　　該研究利用核酸酶P1將小鼠RNA進(jìn)行片段化，得到20–100-nt 大小片段;之后在片段的5"-PO4和3"-OH端分別加上接頭，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增之后，構(gòu)建FragSeq文庫(kù)并對(duì)其進(jìn)行深測(cè)序。為了保證文庫(kù)片段均是由核酸酶P1剪切產(chǎn)生，薩拉馬等設(shè)置了兩個(gè)對(duì)照組：一組RNA不使用核酸酶P1處理來(lái)估算由內(nèi)源降解產(chǎn)生5"-PO4基團(tuán)的片段數(shù)，另一組則多加了T4連接酶處理RNA，以此來(lái)計(jì)算不產(chǎn)生5"-PO4基團(tuán)的片段數(shù)。通過(guò)凝膠電泳分離出目標(biāo)片段。后薩拉馬等利用一種軟件，可以將大量測(cè)序結(jié)果格式化，使其能夠被一種RNA預(yù)測(cè)軟件讀取，進(jìn)而預(yù)測(cè)出RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。