幾種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的研究

　　作者：毛詠秋,李喜榮,雷松　　作者單位：四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都，四川，610041

　　【摘要】本研究評價(jià)幾種臨床常用的抗腫瘤藥物順鉑(CDDP)、羥基喜樹堿(HCPT)、高三尖杉酯堿(HHT)和米托蒽醌(MIT)在白血病治療中的作用，并分析其在誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用，為白血病的臨床治療提供新的理論依據(jù)和思路。用Annexin V/PI雙參數(shù)流式分析方法，檢測這幾種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡和死亡的效應(yīng)。結(jié)果表明：MIT和HCPT在加藥處理早期4小時(shí) (P<0.05)和后期第8小時(shí)(P<0.05)都有明顯的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。HHT有明顯誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的效果，但各劑量組之間無顯著差異。CDDP在高濃度和長時(shí)間作用時(shí)才顯示較弱的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，明顯弱于前3者。各種藥物作用后均未觀察到明顯的細(xì)胞死亡效應(yīng)。結(jié)論：MIT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用顯著，Annexin V流式分析方法可作為一種可靠的臨床藥物篩選的方法。
　　【關(guān)鍵詞】 抗癌藥物;細(xì)胞凋亡;Jurkat細(xì)胞系;Annexin V

　　Effect of Several Anti-tumor Drugs on Apoptosis Induction in Jurkat Cell Line　MAO Yong-Qiu，LI Xi-Rong，LEI Song　State Key Laboratory of Biotherapy，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu，610041，China

　　Abstract Cisplatin (CDDP)，homoharringtonine(HHT)，mitoxantrone(MIT) and hydroxycamptothecin(HCPT) are highly effective anti-tumor drugs. To evaluate their effects in the therapy of leukemia and establish a valuable method to estimate anti-tumor drugs，Annexin V/PI double parameter flow cytometry was used to detect the effects of these drug inducing apoptosis and death in Jurkat cell line. The results showed that MIT and HCTP-induced apoptosis effects on Jurkat cell line were obvious at 4 hours in early phase after adding drug (P<0.05) and at 8 hours in late phase after adding drug (P<0.05). HHT had obvious effect on inducing apoptosis of Jurkat cells，but no significant difference from low to high doses. The effect of CDDP on inducing apoptosis of Jurkat cell line was obviously weaker than that of HHT，MIT and HCPT，its weak effect on apoptosis of Jurkat cell line was found only at high concentration of drug for long time. Death effects on Jurkat cell line can not be observed in every experimental group. It is concluded that low dose of MIT can effectively induced apoptosis of Jurkat cell line. Annexin V/PI double parameter flow cytometry can be used as a reliable method for clinical screening anti-tumor drugs.

　　Key words anti-tumor drug; apoptosis; Jurkat cell line; Annexin V

　　化療是腫瘤治療的一種重要方法，新的抗腫瘤藥物也不斷地涌現(xiàn)。國內(nèi)在上個(gè)世紀(jì)90年代上市的抗癌藥物中化學(xué)合成藥米托蒽醌(MIT)、羥基脲和順鉑(CDDP)等少數(shù)幾種抗癌藥物，通過與DNA分子結(jié)合抑制核酸合成引起細(xì)胞死亡，這類藥物稱之為細(xì)胞周期非特異性藥物。本研究選用米托蒽醌(MIT)、順鉑(CDDP)、羥基喜樹堿(HCPT)、 高三尖杉酯堿(HHT)誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，并通過Annexin V /PI法檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞死亡比例，分析不同作用時(shí)間以及不同藥物濃度對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響。材料和方法

　　材料

　　Jurkat細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。順鉑(CDDP)為齊魯制藥有限公司產(chǎn)品、羥基喜樹堿(HCPT)為黃石飛云制藥廠產(chǎn)品、 高三尖杉酯堿(HHT)為杭州民生藥業(yè)公司產(chǎn)品、米托蒽醌(MIT)為浙江瑞新藥業(yè)公司產(chǎn)品;RPMI 1640為Invitrgen產(chǎn)品;Annexin V FITC/PI試劑盒購自晶美生物公司;貝克曼流式細(xì)胞分析儀 Elite EXP。
　　誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡

　　Jurkat細(xì)胞在5% CO2孵箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期，鏡下計(jì)數(shù)為1×106/ml，加入24孔板，每孔1 ml細(xì)胞懸液。用無血清細(xì)胞懸液將順鉑、 羥基喜樹堿、高三尖杉酯堿和米托蒽醌藥物配制成1 mg/ml溶液;每組藥物分別設(shè)4個(gè)濃度：12.5、25、50、100 μg/ml;分別加入24孔培養(yǎng)板，作3個(gè)復(fù)孔。置于5% CO2孵箱培養(yǎng)。
　　Annexin V/PI流式雙參數(shù)分析[1-3]

　　分別于加入藥物作用2、4和8小時(shí)，吸取培養(yǎng)細(xì)胞懸液，用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，用250 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，使其濃度為1×106/ml;取100 μl細(xì)胞懸液，加5 μl Annexin V/FITC和10 μl (20 μg/ml)的碘化丙錠;混勻后室溫避光孵育15分鐘;用PBS洗滌2次，進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FACS)分析。Annexin V-FITC/PI雙參數(shù)進(jìn)行調(diào)試，以此條件進(jìn)行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死率檢測。圖1-5橫坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)，圖中兩個(gè)峰中的左邊峰表示陰性峰，右峰表示凋亡峰，右峰曲線下面積越大凋亡就越多。根據(jù)所測數(shù)據(jù)計(jì)算細(xì)胞凋亡率和繼發(fā)性壞死率。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　各組細(xì)胞凋亡率均取3個(gè)樣本的均值，以X±SD表示，多個(gè)均數(shù)的兩兩比較采用《中國醫(yī)學(xué)百科全書•醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)》統(tǒng)計(jì)軟件包 (第三版)PEMS 3.1軟件進(jìn)行檢驗(yàn)。
　　結(jié)果

　　CDDP對Jurkat細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用
　　CDDP各劑量組與對照組(未處理組)相比，在其劑量為12.5 μg/ml時(shí)，各個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)上Jurkat細(xì)胞凋亡率均無明顯變化;劑量為25 μg/ml和50 μg/ml時(shí)，在2小時(shí)和4小時(shí)Jurkat細(xì)胞凋亡率也無明顯變化，而在作用8小時(shí)時(shí)Jurkat細(xì)胞凋亡率才有明顯增高，分別為13.6%和23.9%，與對照組相比有顯著差異(P<0.05)。當(dāng)CDDP藥物濃度增大至100 μg/ml時(shí)，作用2小時(shí)和4小時(shí)時(shí)，Jurkat細(xì)胞凋亡率無變化，在8小時(shí)時(shí)Jurkat細(xì)胞凋亡率為19.9%，與50 μg/ml劑量相比，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率不但沒有明顯差別，而且有所降低(圖1)，這表明CDDP的作用有藥物飽和效應(yīng)。
　　HHT對Jurkat細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用
　　HHT各劑量組的細(xì)胞凋亡率與對照組(未處理組)相比均有明顯增高(P<0.05)。Jurkat細(xì)胞凋亡率與藥物劑量關(guān)系不明顯，但與作用時(shí)間明顯成正比。12.5 μg/ml HHT作用2、4和8小時(shí)時(shí)Jurkat細(xì)胞凋亡率分別是4.9%、20.4%和35.4% (P<0.05); 25 μg/ml HHT時(shí)分別為5.5%、12.1%和27.2%;50 μg/ml HHT時(shí)分別為5.8%、12.2%和33.0%; 100 μg/ml HHT時(shí)分別是5.7%，12.1%和35.0% (P<0.05)。不同藥物濃度HHT在同一時(shí)間點(diǎn)之間誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡率沒有明顯差別(圖2)。
　　MIT對Jurkat細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用
　　與對照組(未處理組)相比，MIT各劑量組在作用2小時(shí)時(shí)Jurkat細(xì)胞凋亡率無明顯不同，但隨作用時(shí)間延長均有明顯增高(P< 0.05)。12.5 μg/ml劑量組作用2、4和8小時(shí)時(shí)Jurkat細(xì)胞凋亡率分別是4.2%、20.5%和52.4%(P<0.05)，25 μg/ml組分別為4.9%、30.1%和68.9%， 50 μg/ml組分別是7.2%、37.9%和81.8%(P<0.05) (圖3 )，100 μg/ml組分別為6.6%，41.5%和84.1%，各作用時(shí)間點(diǎn)之間差別均有顯著差異(P<0.05)(圖4)。Jurkat細(xì)胞凋亡率在藥物低劑量時(shí)隨劑量增大明顯增高;100 μg/ml組作用效應(yīng)與50 μg/ml劑量組沒有明顯差別，顯示有劑量飽和效應(yīng)。
　　HCPT對Jurkat細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用
　　HCPT各劑量組與對照組(未處理組)相比，Jurkat細(xì)胞凋亡率均有明顯增高(P<0.05)，Jurkat細(xì)胞凋亡率隨藥物劑量增大和時(shí)間延長而明顯增高，12.5 μg/ml HCPT 劑量組作用2、4和8小時(shí)時(shí)Jurkat細(xì)胞凋亡率分別是3.4%、20.9%和30.3% (P<0.05);而25 μg/ml組分別為3.7%、19.1%和30.3%;50 μg/ml組分別是5.9%、23.8%和44.6% (P<0.05)，100 μg/ml組分別是3.0%、15.8%和55.7%(P<0.05)。HCPT相同劑量不同作用時(shí)間點(diǎn)的Jurkat細(xì)胞凋亡率均有顯著差異(P<0.05) (圖5) ;HCPT不同劑量同一作用時(shí)間點(diǎn)的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡率在2小時(shí)與4小時(shí)間沒有顯著差異，而兩者與8小時(shí)作用相比均有顯著差異(P<0.05)。
　　各藥物組間誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的比較
　　順鉑、高三尖杉酯、米托蒽醌和羥基喜樹堿4種藥物間不同劑量組在作用2小時(shí)時(shí)誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的凋亡率無明顯不同，在4小時(shí)和8小時(shí)時(shí)各組間均有顯著差別(P<0.05，圖6)。藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的強(qiáng)度依次為MIT、HCPT、HHT和CDDP。
　　各藥物組誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞死亡

　　各藥物組均未發(fā)生明顯的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。CDDP誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞死亡的效應(yīng)隨藥物濃度的增高和作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)，在藥物濃度為25、50和100 μg/ml，作用8小時(shí)時(shí)誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞死亡率分別為7.6%、9.9%和10.3%。12.5 μg/ml HHT短時(shí)間和長時(shí)間作用時(shí)細(xì)胞死亡效應(yīng)均不明顯，只在藥物濃度為25、50和100 μg/ml，作用4小時(shí)時(shí)顯示微弱的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞死亡的效應(yīng)，細(xì)胞死亡率分別為6.6%、5.2%和6.6%。MIT只在低藥物濃度12.5 μg/ml和25 μg/ml作用8小時(shí)時(shí)細(xì)胞死亡率分別為4.0%和4.5%(圖7)，藥物濃度增高時(shí)卻并未發(fā)生明顯的細(xì)胞死亡。而HCPT則只在增高藥物濃度至50 μg/ml和100 μg/ml，長時(shí)間作用8小時(shí)時(shí)才發(fā)生細(xì)胞死亡，細(xì)胞死亡率分別為5.0%和9.6%。詳見附表。
　　Table. Effect of anti-tumor drugs on apoptosis of Jurkat cells (略)

　　討 論
　　多種化療藥物可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，如米托蒽醌(MIT)、順鉑(CDDP)、羥基喜樹堿(HCPT)，高三尖杉酯堿(HHT)等。有文獻(xiàn)報(bào)道米托蒽醌可誘導(dǎo)人髓系白血病細(xì)胞凋亡[4]，并逐步用于白血病的治療。CDDP曾用于治療卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌、頭頸部鱗癌、甲狀腺癌及成骨肉瘤等多種實(shí)體腫瘤，均顯示出良好的療效，其機(jī)制是損傷線粒體功能、使DNA 斷裂和抑制細(xì)胞發(fā)育[5]，近有文獻(xiàn)報(bào)道，CDDP可通過引起CD95聚集成簇進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡[6]。然而，其較強(qiáng)的腎毒性限制了其臨床使用。羥基喜樹堿(HCPT)和高三尖杉脂堿(HHT)均是從植物中提取的生物堿，具有顯著的抗癌活性。HCPT在臨床上主要用于結(jié)腸、直腸癌、肺癌及白血病等惡性腫瘤的治療，也有很強(qiáng)的誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞和消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[7，8]。
　　臨床證明，HHT對急性粒細(xì)胞白血病、急性單核細(xì)胞白血病、紅系白血病等各種急性非淋巴性白血病及慢性粒細(xì)胞白血病均有較好的療效。研究表明，HHT可誘導(dǎo)人野生型P53白血病細(xì)胞、HL-60，K562和Jurkat細(xì)胞等凋亡，誘導(dǎo)機(jī)制可能是通過破壞或改變線粒體跨膜電位或細(xì)胞色素C、AIF的釋放和caspase的活化等[9-11]，同時(shí)還有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化和抑制轉(zhuǎn)移的作用[12]。本研究根據(jù)近年的研究成果和臨床白血病治療的問題和現(xiàn)狀，用可靠的Annexin V/PI流式雙參數(shù)分析方法，比較了幾種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用，為解決臨床白血病治療的問題提供新的依據(jù)和思路。
　　細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，膜磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此，Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜磷脂酰絲氨酸外翻的發(fā)生早于細(xì)胞核的變化。本研究結(jié)合鑒定細(xì)胞死活的核酸染料(PI)，使用Annexin V/PI流式雙參數(shù)分析來區(qū)分凋亡細(xì)胞與死亡細(xì)胞，檢測幾種實(shí)驗(yàn)藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡和死亡的效應(yīng)。
　　本研究結(jié)果顯示，各藥物均顯示不同程度的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。CDDP小劑量時(shí)無明顯誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，只在大劑量長時(shí)間作用時(shí)才顯示出誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡效應(yīng)。HHT和MIT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡效應(yīng)均隨藥物劑量增大明顯增高，但HHT各劑量組在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率無明顯變化，MIT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡效應(yīng)隨藥物作用時(shí)間延長而明顯增強(qiáng)。HCPT組不同藥物劑量同一作用時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡率在2小時(shí)與4小時(shí)間沒有顯著差異，但作用8小時(shí)時(shí)均有顯著差異。MIT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡效應(yīng)的強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其他3種藥物，CDDP只顯示微弱的細(xì)胞凋亡效應(yīng)。前3種藥物隨劑量增大均顯示出藥物飽和效應(yīng)。
　　各藥物組均未顯示明顯的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞死亡的變化。CDDP和HCPT只在高藥物濃度長時(shí)間作用時(shí)才顯示微弱的細(xì)胞死亡效應(yīng)。HHT短時(shí)間和長時(shí)間作用時(shí)細(xì)胞死亡效應(yīng)均不明顯，只在藥物作用4小時(shí)時(shí)顯示微弱的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞死亡的效應(yīng)。MIT卻只在低藥物濃度作用時(shí)顯現(xiàn)弱的細(xì)胞死亡效應(yīng)，藥物濃度增高時(shí)細(xì)胞死亡效應(yīng)卻不明顯。上述結(jié)果表明，可能需要延長作用時(shí)間才能顯示明顯的細(xì)胞死亡效應(yīng)。
　　本研究提示，MIT和HCPT在白血病治療方面具有較強(qiáng)作用;同時(shí)提供了一種臨床實(shí)驗(yàn)藥物作用可靠的Annexin V/PI流式雙參數(shù)分析方法。有研究表明，可溶性的腫瘤壞死因子家族配體(sTRAIL)具有明顯的腫瘤細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)和凋亡誘導(dǎo)作用[13]。文獻(xiàn)報(bào)道，NF-κB可增強(qiáng)HHT誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞凋亡[14]?？鼓[瘤藥物與生物制劑聯(lián)合使用將會(huì)給腫瘤治療帶來新的突破。
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