淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3（CD58）在兒童期急性B淋巴細(xì)胞白血病近期療效判斷中的應(yīng)用

作者：趙惠君,蔣黎敏,袁曉軍,李莉,湯靜燕,沈　　作者單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海兒童醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)診斷中心，1血液腫瘤科，上海 200127

　　【摘要】本研究評(píng)估CD58在急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)近期療效判斷中的價(jià)值。應(yīng)用四色流式細(xì)胞分析技術(shù)觀察135例兒童期B-ALL患者CD58分子的表達(dá)特點(diǎn);建立用CD58/CD10/CD34/CD19抗體組合檢測(cè)B-ALL MRD的方案;結(jié)合CD58的表達(dá)情況和MRD監(jiān)測(cè)結(jié)果分析CD58在B-ALL中的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果表明: 135例B-ALL的平均CD58 MFI為113.08±63.33，15例正常骨髓的CD19+CD10+細(xì)胞的平均CD58 MFI為14.68±5.26，兩者差異顯著(P<0.01);51.9%(70/135)B-ALL患者的CD58分子強(qiáng)表達(dá)，可以用CD58為指標(biāo)進(jìn)行MRD檢測(cè);CD58/CD10/CD34/CD19抗體組合的有效頻率僅次于TdT/CD10/CD34/CD19，為51.9%;CD58高表達(dá)組的MRD陽(yáng)性率顯著低于CD58低表達(dá)組(P<0.05)。結(jié)論： CD58可以作為B-ALL MRD檢測(cè)的指標(biāo)，此結(jié)果豐富了MRD檢測(cè)的組合;CD58的高表達(dá)可以作為B-ALL預(yù)后較好的指標(biāo)。
　　【關(guān)鍵詞】 急性B淋巴細(xì)胞性白血病; CD58; 微小殘留病; 淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原

　　Prognostic Significance of Lymphocyte Function Associated Anti-gen-3 (CD58) in Childhood B Cell-Acute Lymphocytic Leukemia　XU Chong，ZHAO Hui-Jun，JIANG Li-Ming，YUAN Xiao-Jun，LI Li，TANG Jing-Yan， SHEN Li-Song　Laboratory Diagnostic Center，1Department of Hematology/Oncology，Shanghai Children Medical Center，Xinhua Hospital，Shanghai Jiaotong University Medical College，Shanghai 200127，China

　　Abstract This study was aimed to investigate the value of CD58 in evaluation of early therapeutic effect on childhood B-ALL. The ex[x]pression features of CD58 in 135 cases of childhood B-ALL were analyzed by four-color flow cytometry; MRD detection protocol for B-ALL using CD58/CD10/CD34/CD19 combination was established; the correlation between the ex[x]pression features of CD58 and MRD detection was analyzed for the early therapeutic response in childhood B-ALL. The results showed that the mean value of CD58 MFI in 135 cases of B-ALL was 113.08±63.33，which was significantly higher than that in 15 cases of normal bone marrow controls (14.68±5.26，P<0.01). In addition，CD58 was over expressed in 51.9% (70/135) of B-ALL patients，indicating that CD58 could be an effective marker in MRD detection. The CD58/CD10/CD34/CD19 was the second most effective combination next to TdT/CD10/CD34/CD19 in B-ALL MRD detection with flow cytometry. Meanwhile，the positive rate of MRD detection by flow cytometry was significantly lower in CD58 over ex[x]pression group (P<0.05). It is concluded that CD58 may be used as an indicator for detection of MRD in B-ALL patients，which would enriche the combination of MRD detection. The CD58 over ex[x]pression may be considered as a marker of a favorable prognosis in childhood B-ALL.

　　Key words B-ALL; CD58; minimal residual disease; lymphocyte function associated antigen

　　CD58又稱(chēng)淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3(lymphocyte function-associated antigen-3，LFA-3)，分子量為28 kD，廣泛表達(dá)于造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞[1]。它是T細(xì)胞表面標(biāo)志CD2的配體，兩者同屬免疫球蛋白超家族成員，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域具有很高的同源性[2]。通過(guò)與CD2的特異性識(shí)別，CD58介導(dǎo)了T細(xì)胞和胸腺上皮細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞以及靶細(xì)胞之間的相互作用，因而在淋巴細(xì)胞的活化、再循環(huán)及效應(yīng)功能(包括針對(duì)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用等)中起到重要作用[3，4]。但作為黏附分子，CD58可能在腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)中起作用。研究表明，在不同的血液系統(tǒng)腫瘤中，CD58的表達(dá)與預(yù)后關(guān)系有所不同[5-8]。但以上研究都是以腫瘤細(xì)胞CD58的陽(yáng)性百分率作為觀察指標(biāo)，并未從CD58在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)量的角度給予關(guān)注。而且CD58在兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)中的預(yù)后作用尚無(wú)明確報(bào)道。
　　本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析了CD58在B-ALL中的表達(dá)特點(diǎn)，建立了用CD58檢測(cè)白血病微小殘留(MRD)的方案，并從CD58在B-ALL細(xì)胞表面表達(dá)量的角度初步評(píng)價(jià)了CD58對(duì)B-ALL在早期療效及預(yù)后判斷中的意義。
　　材料和方法
　　病例

　　135例B-ALL患兒均為本院的住院患者。所有患者都經(jīng)過(guò)FAB分型法及流式細(xì)胞術(shù)免疫分型法明確診斷?；颊叨加肞VDL(潑尼松、長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素和左旋門(mén)冬酰胺酶)方案進(jìn)行誘導(dǎo)緩解治療。在第1療程結(jié)束、達(dá)到臨床緩解后以及在以后的持續(xù)治療過(guò)程中共有75例患者用多種抗體組合進(jìn)行了微小殘留病的監(jiān)測(cè)。正常對(duì)照15例。
　　材料和儀器
　　單克隆抗體 CD58-FITC單克隆抗體購(gòu)自法國(guó)Immunotech公司;CD10-PE單克隆抗體購(gòu)自丹麥Dako公司;CD34-PerCP和CD19-APC單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。
　　儀器

　　流式細(xì)胞儀為FACSCalibur型(美國(guó)Becton Dickinson公司的產(chǎn)品)。
　　CD58在B-ALL中表達(dá)特點(diǎn)的觀察

　　單個(gè)核細(xì)胞分離 將B-ALL初發(fā)患者的骨髓標(biāo)本用Ficoll液(密度1.077±0.002 g/ml)分離單個(gè)核細(xì)胞，用PBSA(含0.2%牛血清白蛋白及0.2%疊氮鈉的PBS)洗2遍，用PBSA懸浮。
　　細(xì)胞膜表面抗原染色
　　調(diào)節(jié)每管細(xì)胞數(shù)為1×106，用CD58-FITC，CD10-PE，CD34-PerCP和CD19-APC單克隆抗體按抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膜表面抗原標(biāo)記，用PBS洗2遍，洗去未結(jié)合抗體，用多聚甲醛懸浮待用。
　　檢測(cè)及分析

　　測(cè)定前先用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校準(zhǔn)儀器。用CellQuest軟件(version 3.2)進(jìn)行收集。所有患者標(biāo)本都用同一設(shè)定條件檢測(cè)。結(jié)果用CellQuest軟件(version 3.2)進(jìn)行分析。用Sigma Plot軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。
　　微小殘留監(jiān)測(cè)

　　首先確定適合用CD58/CD10/CD34/CD19抗體組合進(jìn)行MRD監(jiān)測(cè)的病例。在CD58/CD10雙參數(shù)圖上，以白血病細(xì)胞分布在不同于正常細(xì)胞出現(xiàn)的區(qū)域且與正常細(xì)胞區(qū)域無(wú)重疊者確定為CD58/CD10/CD34/CD19抗體組合適用。
　　然后以適合用CD58/CD10/CD34/CD19抗體組合進(jìn)行MRD監(jiān)測(cè)的患者，其誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束后以及持續(xù)治療過(guò)程中的骨髓標(biāo)本經(jīng)Ficoll液分離單個(gè)核細(xì)胞以后，用CD58/CD10/CD34/CD19抗體組合進(jìn)行標(biāo)記。其他抗體組合如TdT/CD10/CD34/CD19，CD38/CD10/CD34/CD19，CD45/CD10/CD34/CD19，CD66c/CD10/CD34/CD19和CD22/CD10/CD34/CD19檢測(cè)MRD的方法見(jiàn)文獻(xiàn)[9]所述。分析時(shí)，如果在初發(fā)白血病細(xì)胞出現(xiàn)的區(qū)域內(nèi)仍有細(xì)胞存在，即判定為MRD陽(yáng)性。以這些殘存的細(xì)胞占骨髓單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)的比例作為MRD的數(shù)值。
　　CD58對(duì)于B-ALL早期療效及預(yù)后的意義的初步評(píng)估
　　將進(jìn)行過(guò)MRD監(jiān)測(cè)的B-ALL患兒分為CD58高表達(dá)和CD58低表達(dá)兩組。其分組原則為：患兒CD58過(guò)強(qiáng)表達(dá)，以致B-ALL細(xì)胞在流式CD58和CD10雙參數(shù)點(diǎn)圖上與骨髓正常CD19+CD10+的細(xì)胞無(wú)重疊，明顯區(qū)分開(kāi)時(shí)，確認(rèn)為CD58高表達(dá)組;而其余病例的B-ALL細(xì)胞在流式CD58和CD10雙參數(shù)點(diǎn)圖上與骨髓正常CD19+CD10+的細(xì)胞有重疊無(wú)法明顯區(qū)分時(shí)，確認(rèn)為CD58低表達(dá)組。用χ2檢驗(yàn)分析這2組病例與MRD監(jiān)測(cè)結(jié)果的關(guān)系。
　　結(jié) 果
　　CD58在B-ALL中的表達(dá)特點(diǎn)

　　B-ALL患者的白血病細(xì)胞CD58陽(yáng)性率平均為9218%，中位數(shù)為98.82%(2.47%-99.99%)，887%的患者CD58表達(dá)率在80%以上。平均熒光強(qiáng)度(median fluorescent intensity，MFI)可以反映細(xì)胞膜表面或胞漿內(nèi)的抗原表達(dá)量，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CD58 的MFI對(duì)B-ALL和正常骨髓中CD19+CD10+細(xì)胞膜表面的CD58表達(dá)量作比較(圖1)。實(shí)驗(yàn)研究表明，135例B-ALL的平均CD58 MFI為113.08±63.33，15例正常骨髓的平均CD58 MFI為14.68±5.26，兩者差異顯著(P<0.01)。
　　用CD58/CD10/CD34/CD19抗體組合檢測(cè)B-ALL MRD方法的建立
　　CD58在B-ALL患者骨髓中的表達(dá)量顯著高于正常骨髓，如果白血病細(xì)胞與正常骨髓中CD19+CD10+細(xì)胞的CD58 MFI無(wú)重疊，即可作為MRD檢測(cè)的有效指標(biāo)。如圖2所示，Ai-Aiii為正常骨髓細(xì)胞，在Ai中以R1選取單個(gè)核細(xì)胞;在Aii中以R2選取CD19+的單個(gè)核細(xì)胞;正常骨髓的CD19+單個(gè)核細(xì)胞在CD58和CD10雙參數(shù)點(diǎn)圖上的分布如Aiii所示，R3為正常B細(xì)胞所不會(huì)出現(xiàn)的區(qū)域，以“空白區(qū)”表示。“空白區(qū)”位置的設(shè)定是MRD檢測(cè)的關(guān)鍵。
　　Bi，Bii和Biii 3例初診時(shí)的B-ALL患者的白血病細(xì)胞分別分布在R3“空白區(qū)”中，并且與正常B細(xì)胞的分布范圍無(wú)重疊，因此這3例患者可用CD58/CD10/CD34/CD19抗體組合進(jìn)行MRD檢測(cè)。Ci和Cii分別對(duì)應(yīng)Bi和Bii，為2例患者經(jīng)治療達(dá)臨床緩解時(shí)的MRD監(jiān)測(cè)結(jié)果，在“空白區(qū)”中與初診時(shí)白血病細(xì)胞分布的相同位置無(wú)殘存細(xì)胞出現(xiàn)，MRD判為陰性結(jié)果。Ciii，“空白區(qū)”中與Biii所示初診時(shí)白血病細(xì)胞分布相同位置仍有殘留細(xì)胞出現(xiàn)，MRD判為陽(yáng)性，經(jīng)計(jì)算MRD結(jié)果為0.91%。
　　CD58在135例B-ALL MRD檢測(cè)中的適用頻率

　　如表1所示，在對(duì)135例B-ALL患者進(jìn)行的MRD有效指標(biāo)(即某指標(biāo)在白血病細(xì)胞與正常骨髓細(xì)胞中CD19+CD10+細(xì)胞的MFI無(wú)重疊，可將白血病細(xì)胞和正常CD19+CD10+細(xì)胞明確區(qū)分的，則可作為MRD檢測(cè)的有效指標(biāo))篩選中，CD58的有效頻率(即CD58指標(biāo)有效，可以用CD58組合進(jìn)行MRD檢測(cè)的患者例數(shù)在135例B-ALL患者中所占的比例)僅次于TdT，為51.9%，這在很大程度上豐富了MRD檢測(cè)的組合。Table 1. Efficient frequency of CD58 in MRD detection in 135 cases of B-ALL(略)

　　CD58在B-ALL細(xì)胞表面表達(dá)量與MRD監(jiān)測(cè)結(jié)果的關(guān)系
　　迄今為止，MRD的監(jiān)測(cè)結(jié)果是預(yù)示白血病復(fù)發(fā)的可靠的依據(jù)[10]。本研究按CD58 MFI是否與正常骨髓細(xì)胞有重疊將75例已進(jìn)行過(guò)MRD監(jiān)測(cè)的病例分為CD58高表達(dá)和低表達(dá)2組，觀察2組病例與MRD監(jiān)測(cè)結(jié)果的關(guān)系。結(jié)果顯示，CD58高表達(dá)組的MRD陽(yáng)性率顯著低于CD58低表達(dá)組(P<005)(表2)。這表明CD58高表達(dá)組的白血病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較小。Table 2. CD58 ex[x]pression and results of MRD in B-ALL(略)

　　討 論
　　在T細(xì)胞和靶細(xì)胞的黏附作用中，有3個(gè)淋巴細(xì)胞功能相關(guān)結(jié)構(gòu)參與其中，分別是：T細(xì)胞膜表面的LFA-1(CD11a/CD18)和LFA-2(CD2)以及靶細(xì)胞膜表面的LFA-3(CD58)[2]。黏附分子CD58是CD2的配體，兩者的結(jié)合不僅促進(jìn)了細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)與靶細(xì)胞的結(jié)合，同時(shí)也為CTL活化與增殖提供了必要的信號(hào)。
　　已有研究表明，在Burkitt淋巴瘤和T淋巴細(xì)胞白血病中，CD58的表達(dá)減少是腫瘤細(xì)胞逃避CTL和NK細(xì)胞的殺傷的重要機(jī)制;CD58的高表達(dá)率應(yīng)是疾病預(yù)后良好的標(biāo)志[5，6]。Roux等[11]發(fā)現(xiàn)霍奇金淋巴瘤細(xì)胞表面的CD58分子脫落，造成血漿游離CD58參與競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CTL表面CD2，從而抑制靶細(xì)胞與CTL結(jié)合以及T細(xì)胞活化，這可能是造成淋巴瘤細(xì)胞逃逸的重要機(jī)制。這些觀點(diǎn)都支持LFA-2(CD2)-LFA-3(CD58)路徑在機(jī)體抑制腫瘤機(jī)制中的積極作用。但也有研究者提出不同的觀點(diǎn)。在慢性B淋巴細(xì)胞白血病中，CD58陽(yáng)性的病例脾腫大的發(fā)生率較高，對(duì)病程發(fā)展更不利[8]。這也說(shuō)明，作為黏附分子的CD58也可能在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲性中起作用。Oblakowski等[7]認(rèn)為，對(duì)于髓細(xì)胞白血病，在機(jī)體抗腫瘤機(jī)制中起作用的是LFA-1(CD11a/CD18)和ICAM-1(CD54)黏附系統(tǒng)，而不是CD2-CD58系統(tǒng)。
　　但迄今為止，對(duì)于CD58的表達(dá)在B-ALL中的作用的研究尚少見(jiàn)。僅有Kebelmann-Betzing等[12]通過(guò)對(duì)10例復(fù)發(fā)的B-ALL患兒的研究指出，在復(fù)發(fā)的B-ALL患兒的白血病細(xì)胞中，CD58陽(yáng)性率中位數(shù)為46%(1%-90%)，其中40%的病例CD58陽(yáng)性細(xì)胞大于50%;而70%的病例CD54陽(yáng)性細(xì)胞小于20%。作者據(jù)此認(rèn)為，CD54的弱表達(dá)或陰性表達(dá)使CTL參與的免疫反應(yīng)受損，這是B-ALL復(fù)發(fā)的機(jī)制之一。然而，該研究只是以CD58表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比作為觀察指標(biāo)，并沒(méi)有考慮CD58在B-ALL細(xì)胞表面表達(dá)的量在早期療效及預(yù)后中可能起到的作用。
　　Chen等[13]用基因芯片技術(shù)篩選B-ALL 的MRD檢測(cè)新指標(biāo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在一些B-ALL中存在CD58 mRNA過(guò)強(qiáng)表達(dá)，CD58分子在B-ALL細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)的現(xiàn)象。但至今仍無(wú)CD58與B-ALL預(yù)后關(guān)系的明確報(bào)道。
　　本研究對(duì)135例B-ALL的CD58表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示88.7%的患者CD58表達(dá)率在80%以上，CD58的廣泛高表達(dá)率成為兒童期B-ALL的特點(diǎn)。因此，僅從CD58的陽(yáng)性百分率來(lái)評(píng)估CD58在兒童期B-ALL早期療效中的作用是明顯不夠的，也是不妥當(dāng)?shù)?。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在CD58廣泛高表達(dá)的背后還存在著該蛋白分子表達(dá)量的差異，而CD58表達(dá)量的差異則可能存在著造成預(yù)后不同的潛在的可能性。
　　研究結(jié)果顯示，135例B-ALL中CD58蛋白分子的總體表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常骨髓中的CD19+CD10+細(xì)胞。51.9%(70/135)B-ALL患者的CD58分子過(guò)強(qiáng)表達(dá)，CD58 MFI與正常骨髓細(xì)胞MFI無(wú)重疊。借此可以用CD58/CD10/CD34/CD19進(jìn)行B-ALL的MRD檢測(cè)，從而豐富了MRD檢測(cè)的抗體組合，進(jìn)一步提高了MRD的檢出率。
　　MRD監(jiān)測(cè)結(jié)果目前仍是預(yù)示白血病復(fù)發(fā)可靠的判斷依據(jù)[10]。本研究結(jié)合CD58的表達(dá)水平與MRD監(jiān)測(cè)結(jié)果初步評(píng)估了CD58在B-ALL預(yù)后判斷中的價(jià)值，特別是近期療效判斷中的價(jià)值。研究結(jié)果顯示，CD58高表達(dá)的患者中MRD為陽(yáng)性的患者比例顯著低于CD58低水平表達(dá)的患者，即CD58高表達(dá)的患兒的白血病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著低于CD58低表達(dá)者。其機(jī)制可能是白血病細(xì)胞CD58的高表達(dá)使其增加了與CTL表面的CD2分子的作用機(jī)會(huì)，LFA-2(CD2)-LFA-3(CD58)黏附系統(tǒng)促進(jìn)了CTL與靶細(xì)胞的相互作用，在機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)中起了積極作用。因此，CD58的過(guò)強(qiáng)表達(dá)可以作為B-ALL預(yù)后較好的指標(biāo)。
　　對(duì)于CD58高表達(dá)所致的較好的近期療效，其確切機(jī)理仍有待于進(jìn)一步的研究來(lái)闡明。
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