Hepsin、Maspin在宮頸疾病中的表達(dá)及其臨床意義

        子宮頸癌是全球婦女中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤半數(shù)以上，患者近年來(lái)有年輕化的趨勢(shì)。hepsin基因位于人染色體19qll - q13.2上，hepsin在宮頸癌細(xì)胞中的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道極少。maspin基因證實(shí)其為絲氨酸蛋白酶抑制基因陋3，其與宮頸癌的關(guān)系國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。本研究從核酸水平和蛋白水平檢測(cè)hepsin和maspin在宮頸癌中的表達(dá)情況，并研究二者在官頸癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系，探討對(duì)宮頸癌的診斷、治療、預(yù)后及放化療后的病情判斷有一定的參考價(jià)值。 
        1 資料和方法 
        1.1資料
        1.1.1 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄一多聚酶鏈反應(yīng)( Real -time fluorescent quantitative reverse transc[x]riptasepolymerase chain reaction，QRT - PCR)法 收集2009年9月至2010年4月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科新鮮手術(shù)標(biāo)本65例。所有患者術(shù)前均未接受放療和化療。正常宮頸組織20例，官頸上皮內(nèi)瘤變( cervical intraepithelial neoplasia, CIN)組13例，其中CIN I 3例，CINⅡ2例，CINⅢ8例，官頸癌組32例。 
        1.1.2兔疫組化 收集2009年9月至2010年5月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科新鮮手術(shù)標(biāo)本和2007年4月至2010年5月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔蠟塊共計(jì)127例。所有患者術(shù)前均未接受放療和化療。正常宮頸組織20例，CIN組45例，其中CIN I9例，CINⅡ8例，CINⅢ28例，宮頸癌組62例。 2組資料均根據(jù)2000年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟( FICO)修訂的臨床分期方案進(jìn)行臨床分期。根據(jù)1988年國(guó)際婦科病理協(xié)會(huì)(ISGP)腫瘤病理分級(jí)方案進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)。65例做QRT - PCR同時(shí)取標(biāo)本行免疫組化試驗(yàn)，以排除不同個(gè)體之間的差異。 
        1.2儀器和試劑 
        1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR ABI PRISM 7300熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，U．S．A），連續(xù)光譜熒光酶標(biāo)儀（Thermo Electron corporation）；TRIzolReagent( Cat: N0 15596 - 026, Invitrogen公司)4cC保存，One Step SYBR Primesc[x]ript TM RT - PCR kitⅡ（大連寶生物工程有限公司）一20℃保存；PCR引物（大連寶生物工程有限公司），以18SrRNA作為肉參照。詳見(jiàn)表1。 

        1.2.2免疫組化兔抗人Maspin（H-130）多克隆抗體（sc - 22762），購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology.Inc.，適用稀釋濃度1：50；兔抗人Hepsin多克隆抗體( ab27765)，購(gòu)自abcam( Hong Kong)，適用稀釋濃度1：40；SP - 9000通用型試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。
        1.3方法
        1.3.1實(shí)時(shí)定量PCR利用生物信息學(xué)(http：//www. ncbi. nil. nih．gov)和參考文獻(xiàn)找出基因序列，以18SrRNA為內(nèi)參照，由大連寶生物工程有限公司合成。官頸組織總RNA抽提后參照大連寶生物工程有限公司的One Step SYBR Primesc[x]ript TMRT - PCR kitⅡ說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總體積20ul。將八連管置于7300熒光定量PCR儀上，擴(kuò)增條件：Stagel：42℃逆轉(zhuǎn)錄5 min; Stage2：95℃預(yù)變性10 s；Stage3：95℃變性5 s，600C退火、延伸31 s(50
個(gè)循環(huán))；Stage4：ABI7300系統(tǒng)自動(dòng)添加。根據(jù)公式RQ=2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 
        1.3.2 免疫組化 染色參見(jiàn)SP - 9000說(shuō)明書，DAB顯色，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，Hepsin以肝癌細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，Masppin以生物公司提供的陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照。 
        1.3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 每一批免疫組化均設(shè)已知陽(yáng)性對(duì)照和用PBS代替一抗的空白對(duì)照。顯微鏡下細(xì)胞核和／或細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽(yáng)性染色細(xì)胞。由兩名正職稱病理診斷醫(yī)師分別對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行雙盲法評(píng)估。每一切片隨機(jī)選擇4個(gè)低倍視野( xl00)．在高倍鏡(x400)下計(jì)數(shù)每個(gè)視野100個(gè)腫瘤細(xì)胞，非癌組織則計(jì)數(shù)著色區(qū)100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的比例，根據(jù)切片的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例和染色強(qiáng)度對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分判定，避開腫瘤邊緣及壞死區(qū)域，取4個(gè)視野的平均百分?jǐn)?shù)為判定結(jié)果。 腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：I級(jí)0分，≤10%；Ⅱ級(jí)1分，11%- 240-/0；Ⅲ級(jí)2分，25% -50%；Ⅳ級(jí)3分，>50%。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)染色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；深棕色為3奇=免疫組化結(jié)果根據(jù)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)要分別評(píng)分，兩者乘積0 -1分為陰性（一）；2-4分匈弱陽(yáng)性(+)；5 -6分為陽(yáng)性(++)；6分以上強(qiáng)翠性(+++)。其中（一）和(+)記為低表達(dá)，(++)司(+++)記為高表達(dá)。 
        1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)愛(ài)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以x+s表示，比較采用f檢驗(yàn)或方差分析（兩兩比較采用q檢驗(yàn)），計(jì)數(shù)資料比較采用、一檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 
        2.結(jié)果
        2.1實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果
        2.1.1hepsin的表達(dá)與臨床關(guān)系 結(jié)果顯示hepsin的表達(dá)在CIN I、Ⅱ、Ⅲ中是正常宮頸組織的4.4倍；在宮頸癌中是正常宮頸組織的12.7倍，隨著宮頸癌級(jí)別的增高而增高，即hepsin的表達(dá)與宮頸癌病情呈正相關(guān)。詳見(jiàn)表2、3，圖1、2。

　　
　　
        2.1.2maspin的表達(dá)與臨床關(guān)系 
        結(jié)果表明
        maspin的表達(dá)在CIN中是正常官頸的0.7倍；在宮頸癌中是正常官頸的0.3倍，隨著宮頸癌級(jí)別的增高而降低，即maspin的表達(dá)與宮頸癌病情呈負(fù)相關(guān)。詳見(jiàn)表4、5，圖3、4。 2.2免疫組化結(jié)果
        2.2.1Hepsin蛋白在正常宮頸、CIN和官頸癌組織中的表達(dá)情況 Hepsin蛋白主要表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，染色為深褐色。Hepsin的表達(dá)在正常官頸、CIN和宮頸癌間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但在CIN I、Ⅱ、Ⅲ三組間比較因樣本量過(guò)少，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表6。 
        2.2.2 Maspin蛋白在正常宮頸、CIN和宮頸癌組織中的表達(dá)情況 Maspin蛋白主要表達(dá)于正常宮頸細(xì)胞的細(xì)胞腆和細(xì)胞漿中，染色為深褐色。Maspin的表達(dá)在正常宮頸、CIN和宮頸癌間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但是CIN I、Ⅱ、Ⅲ三組間比較因樣本量過(guò)少，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表7。

2.2.3宮頸癌中Hepsin、Maspin蛋白表達(dá)之間的相互關(guān)系 62例宮頸癌標(biāo)本中，Hepsin與Maspin同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性為27. 40-/0( 17/62)，同時(shí)表達(dá)陰性為9.7%( 6/62)，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.276，P<0. 05)。詳見(jiàn)表8。 
        二．2.4官頸癌組織中Hepsin、Maspin與臨床病理因素的關(guān)系 62例宮頸癌標(biāo)本中，Hepsin、Maspin兩種蛋白的表達(dá)與患者年齡、組織類型和淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而與臨床分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著宮頸癌臨床分期的增高Hepsin的表達(dá)增強(qiáng)，而Maspin的表達(dá)降低或缺失。詳見(jiàn)表9。 52例宮頸鱗癌組織標(biāo)本中，Hepsin、Maspin兩種蛋白的表達(dá)與病理分級(jí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。隨著宮頸鱗癌病理分級(jí)的增高Hepsin的表達(dá)增強(qiáng)，而Maspin的表達(dá)降低或缺失。詳見(jiàn)表10。

        3討論
        腫瘤的發(fā)生是多因素、多基因、多階段協(xié)同作用的結(jié)果，幾乎在所有腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中都有癌基因的過(guò)表達(dá)和／或抑癌基因的表達(dá)缺失。宮頸癌居我國(guó)女性生殖系惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅廣大婦女的健康，因此對(duì)hepsin、maspm在子宮頸癌中的表達(dá)和意義進(jìn)行更深入的研究，對(duì)臨床有一定的指導(dǎo)意義， 
        3.1 hepsin
        hepsin基因位于人染色體19qll - q13.2上，Leytus等克隆確定。Hepsin蛋白屬于一種Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，在細(xì)胞外的基質(zhì)降解中可能發(fā)揮重要作用。hepsin在許多腫瘤如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌等癌細(xì)胞中超表達(dá)。近的研究說(shuō)明hepsin表達(dá)水平也可以作為前列腺癌超前診斷的一個(gè)重要標(biāo)記物。 hepsin基因如何調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。近有學(xué)者認(rèn)為hepsin通過(guò)活化的雙鏈肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子( HGF)導(dǎo)致基底膜降解、細(xì)胞之間的黏附消失以促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
        目前有許多研究提出hepsin通過(guò)HGF/Met信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。目前有很多研究提出hepsin可以通過(guò)裂解前體尿激酶型纖溶酶原激活物（pro - uPA）的蛋白質(zhì)分解路徑，導(dǎo)致基底膜降解，促進(jìn)癌組織的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。Aimes等[16]研究提示hepsin在新生血管的形成中發(fā)揮作用。因此hepsin可能通過(guò)多種途徑促進(jìn)癌組織的浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移。 hepsin在宮頸癌細(xì)胞中的研究目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道較步，本研究結(jié)果提示hepsin的異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)關(guān)系，可能扮演癌基因的角色，取官頸組織行hepsin監(jiān)測(cè)可以幫助診斷宮頸癌，也可用于宮頸癌放化療前后的對(duì)比，對(duì)病情及預(yù)后判斷有一定的參考價(jià)值。 
        3.2 maspin
        maspin基因是1994年Zou Z等發(fā)現(xiàn)的，證實(shí)其為絲氨酸蛋白酶抑制劑基因。maspin主要以可溶形式存在于細(xì)胞漿，也可定位于細(xì)胞表面或細(xì)胞核內(nèi)。盡管maspln在正常組織和一些原位癌也有表達(dá)，但是隨著腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，表達(dá)逐漸消失。研究發(fā)現(xiàn)用質(zhì)粒或反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染乳腺腫瘤細(xì)胞使其maspin表達(dá)上調(diào)后，腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移被明顯抑制，maspin陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞其穿過(guò)基底膜的能力明顯低于maspin陰性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。 maspin已經(jīng)為惡性腫瘤的診斷和治療提供了一種新的有效途徑。有學(xué)者嘗試將maspin作為腫瘤基因標(biāo)記物，用于腫瘤預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)、腫瘤亞型鑒別及化療效果監(jiān)測(cè)，其效果還在進(jìn)一步的研究總結(jié)中。以maspin為靶點(diǎn)的抗腫瘤基因治療也必將受到越來(lái)越多的關(guān)注。
         maspin作為一種抑癌基因有抑制官頸癌發(fā)生發(fā)展的作用，可望成為臨床早期預(yù)測(cè)官頸癌及進(jìn)行預(yù)防性化療的新的參考指標(biāo)，同時(shí)也可以作為判斷宮頸癌轉(zhuǎn)移潛能和惡性程度，評(píng)估患者預(yù)后的參考指標(biāo)，可能成為從基因水平治療的新靶點(diǎn)，還可避免化療中毒。 maspin在官頸癌細(xì)胞中的研究目前是一熱門，本研究結(jié)果顯示maspin的異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能起抑制作用，可能扮演抑癌基因的角色。 
        3.3 Hepsin與Maspin
        絲氨酸蛋白酶類是大且高度保守的蛋白水解酶家族。而Hepsin和Maspin均為絲氨酸蛋白酶家族，Hepsin是一種Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，Maspin是一種絲氨酸蛋白酶抑制因子，兩者結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有相似之處。徐勇等研究顯示Hepsin在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)，而Maspin的表達(dá)下調(diào)，與本研究結(jié)果相同。hepsin/Hepsin在官頸癌中的表達(dá)上調(diào)和maspin/Maspin的表達(dá)下調(diào)，在官頸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有重要的作用，hepsin/Hepsin和maspin/Maspin之間的不平衡發(fā)展可能導(dǎo)致官頸癌的友生，并且其表達(dá)水平與宮頸癌的預(yù)后密切相關(guān)。我們認(rèn)為聯(lián)合檢測(cè)hepsin/Hepsin和maspin/Maspin的表達(dá)水平有助于官頸癌的診斷和判斷預(yù)后，它們有可能成為一對(duì)新的官頸癌標(biāo)記物。